La complémentarité du test biologique à l'analyse chimique traditionnelle n'est plus à démontrer. Les critères de simplicité, rapidité et précision du dernier biotest normé, le test des bactéries luminescentes (Afnor T90-320), donnent la possibilité à chacun de déterminer quantitativement la toxicité des eaux résiduaires. Le paramètre CI50 caractérisant cette toxicité globale est directement obtenu grâce au système Lumistox. Le contrôle des effluents n'est plus aujourd'hui la seule utilisation de ce test. En effet, les graves problèmes liés aux sols contaminés sont à la base d'un nouveau champ d'application.
Les risques toujours plus grands de pollutions accidentelles, et la demande grandissante de contrôles perfectionnés des eaux résiduaires et de la gestion de l’eau potable, ont eu entre autres pour conséquence la diminution des concentrations maximales autorisées pour les substances chimiques qu’elles contiennent. Pour les détecter, la chimie analytique traditionnelle n’étant plus toujours utilisable de façon rentable, et surtout ne tenant souvent pas compte d’effets additionnels possibles, de nouveaux moyens de surveillance ont été mis en œuvre afin d’obtenir la meilleure approche quant à la toxicité d’un échantillon.
Complémentarité des analyses chimiques et biologiques
Biotest et toxicité
Le test biologique, ou biotest, est un procédé d’analyse qui permet de mettre en évidence, de manière mesurable, les effets toxiques d’un échantillon aqueux sur des organismes vivants, en obtenant un paramètre global (similaire à la DCO). Le biotest se différencie donc d’une analyse chimique, avec laquelle on détermine qualitativement et quantitativement une substance chimique contenue dans un échantillon. Étant donné qu’un grand nombre de réactions chimiques restent inconnues, seule une partie des substances présentes est détectable.
Pour déterminer la contamination des milieux aqueux, il existe plusieurs formes de tests biologiques : du test Daphnie bien connu, au test des bactéries luminescentes, ces biotests ont en commun la possibilité de déterminer de manière quantitative la toxicité d’un milieu aqueux ; ils proposent une complémentarité nécessaire et pleine de bon sens à la chimie analytique (figure 1). Le tableau 1 présente les caractéristiques de quatre exemples de tests biologiques. Ces organismes vivants, de types différents (monde bactérien, règne végétal, règne animal), ne donneront pas nécessairement le même résultat pour le même échantillon. Par contre, pour un ensemble d’échantillons, aucun d’eux n’apparaîtra comme le plus ou le moins sensible.
Le test des bactéries luminescentes a déjà fait ses preuves dans différents pays, et fait l’objet de plusieurs normes (Hollande, Allemagne, France...) ; son utilisation la plus courante est la surveillance des effluents. À l’heure actuelle, un nouveau champ d’application se développe, l’étude des échantillons solides.
Les bactéries luminescentes
La mesure de toxicité
Le test des bactéries luminescentes se distingue des autres biotests par deux caractéristiques :
- • la durée de l’analyse de l’échantillon, qui est de 5, 15 ou 30 minutes, donc nettement plus rapide par rapport aux autres biotests ;
- • les organismes de tests, qui sont disponibles sous forme de lots de bactéries prêts à l’emploi, ce qui représente non seulement un gain de temps, de matériel et de place, donc une meilleure rentabilité, mais aussi une très grande facilité d’emploi.
Les bactéries luminescentes [2] sont
Tableau IExemples de biotests
| Test avec poissons | Test avec algues | Test avec daphnées | Test avec bactéries |
|---|---|---|---|
| Dénomination | |||
| Norme : NF T90-303 | NF T90-304 | NF T90-301 | T90-320 |
| Organismes tests : Brachydanio rerio | Scenedesmus subspicatus | Daphnia magna | Photobacterium phosphoreum |
| Représentatif pour : Poissons | Algues | Invertébrés | Bactéries |
| Principe de mesure : Survie | Taux de croissance | Mobilité | Bioluminescence |
| Durée du test : 48 h | 72 h | 24 h | 5, 15 ou 30 mn |
| Résultat : LD* | LD* | LD* | CI** |
| Exigences pratiques : Élevage, acclimatation, encombrement | Stérilité pour les souches, fluorimètre | Culture standardisée, climatisation | Luminomètre, unité d'incubation 15 °C |
* LD : Lethal Dosis.
** CI : Concentration inhibitrice.
Des bactéries marines gram négatives, issues de la souche Photobacterium phosphoreum (aussi nommée Vibrio fischeri) NRRL B-11177, appartenant à la famille des Vibrionaceae. Ces bactéries (agents non pathogènes) n'ont jamais été cause d'aucune maladie, aussi aucune précaution particulière n'est-elle requise lors de la manipulation. Leur principale propriété, utilisée dans le biotest, est leur capacité à émettre de la lumière : l'intensité de cette émission lumineuse, appelée luminescence, dépend du milieu dans lequel elles se trouvent ; plus le milieu contient des éléments toxiques pour les bactéries, plus cette intensité diminue. Les bactéries luminescentes que nous utilisons sont cultivées, puis conditionnées, dans des cuves soumises au procédé de séchage (liquid drying [3]) et enfin stockées à –18 °C dans des boîtes, dont chacune est répertoriée avec un numéro de lot et une date de péremption. L'utilisateur peut alors réactiver les bactéries, selon ses besoins, avec la solution de réactivation jointe, puisqu'elles sont conditionnées dans dix cuves indépendantes par boîte. Une fois réactivée, la suspension bactérienne, tempérée à 15 °C, est utilisable pendant une durée de trois heures.
Principe du test
Après que les bactéries aient été réactivées, puis fractionnées dans les cuves, elles sont placées à 15 °C dans un bloc d'incubation tempéré à 15 °C, ce qui est nécessaire à la préparation et à l'utilisation des cuves pendant le test. L'échantillon est salé à 2 % avec du NaCl (les bactéries marines, en tant qu'organismes marins, ont besoin d'une certaine teneur en sel). Son pH est réajusté si nécessaire entre 5,5 et 8,5. L'échantillon est alors dilué selon une série géométrique avec une solution de NaCl à 2 %, laquelle est également utilisée comme référence (« blanc »). Les cuves contenant les différentes dilutions de l'échantillon ainsi que l'échantillon non dilué et le blanc sont également placées dans l'appareil, face aux cuves contenant la suspension bactérienne (voir encadré).
L'intensité émise par les bactéries luminescentes est mesurée par le Lumistox, luminomètre doté d'un photomultiplicateur, qui détecte les signaux relativement faibles émis par les bactéries luminescentes et les amplifie électroniquement. Afin d'éviter des différences de température entre le lieu de mesure et le bloc d'incubation, son puits de mesure est aussi tempéré à 15 °C. La luminescence de départ des bactéries est mesurée et enregistrée [4]. Aux différentes cuves contenant les bactéries, on ajoute en quantités égales les différentes dilutions de l'échantillon. L'intensité émise par chaque cuve de bactéries est alors mesurée à la fin du temps de contact. Toutes ces opérations sont effectuées en double détermination. Le temps d’incubation étant d'une importance déterminante pour le résultat de l'analyse, il est nécessaire de procéder aux mesures avec une cadence régulière. L'appareil enregistre alors automatiquement la cadence de l'opérateur entre les mesures des deux premières cuves, et indique pour les mesures suivantes le moment exact où l'analyse doit être effectuée.
Tableau IIPrésentation des résultats et calcul de la CI50 par Lumistox
Version 1.05
Date : 26 nov. 1992
Heure : 18 h 30
Opérateur : ALR
Échantillon :
pH :
Prétraitement :
Bactéries :
Origine :
Lot n° :
Commentaire :
Nombre de dilutions : 6
Type de dilution : NF
Conc. d'origine : 100,0 %
Temps d'incubation 1 : 5 min
Temps d'incubation 2 : 15 min
Temps d'incubation 1 :
| Test | Conc. % | Io | It | Inhib. % |
|---|---|---|---|---|
| CB1 | — | 827,5 | 945,4 | –1,25 |
| CC1 | — | 833,6 | 928,7 | 1,25* |
| B2 | 1,56 | 805,2 | 819,3 | 9,82* |
| C2 | 1,56 | 838,5 | 847,8 | 10,39 |
| B3 | 3,13 | 828,8 | 798,2 | 14,64 |
| C3 | 3,13 | 789,1 | 774,7 | 12,98 |
| B4 | 6,25 | 793,8 | 669,3 | 25,27 |
| C4 | 6,25 | 821,9 | 705,2 | 23,96 |
| B5 | 12,50 | 788,1 | 525,6 | 40,89 |
| C5 | 12,50 | 837,7 | 545,4 | 42,30 |
| B6 | 25,00 | 811,0 | 376,2 | 58,26 |
| C6 | 25,00 | 788,6 | 376,7 | 57,66 |
| B7 | 50,00 | 840,9 | 218,3 | 76,99 |
| C7 | 50,00 | 805,1 | 212,9 | 76,56 |
BR : 1,13
CI50 : 17,03 %
Temps d'incubation 2 :
| Test | Conc. % | Io | It | Inhib. % |
|---|---|---|---|---|
| CB1 | — | 827,5 | 912,1 | –0,14* |
| CC1 | — | 833,6 | 916,2 | 0,14* |
| B2 | 1,56 | 805,2 | 787,5 | 11,14 |
| C2 | 1,56 | 838,5 | 822,6 | 10,86 |
| B3 | 3,13 | 828,8 | 760,2 | 16,67 |
| C3 | 3,13 | 789,1 | 740,6 | 14,73 |
| B4 | 6,25 | 793,8 | 660,8 | 24,37 |
| C4 | 6,25 | 821,9 | 681,1 | 24,70 |
| B5 | 12,50 | 788,1 | 524,4 | 39,54 |
| C5 | 12,50 | 837,7 | 542,0 | 41,22 |
| B6 | 25,00 | 811,0 | 386,1 | 56,75 |
| C6 | 25,00 | 788,6 | 304,1 | 54,56 |
| B7 | 50,00 | 840,9 | 261,2 | 71,78 |
| C7 | 50,00 | 805,1 | 262,8 | 71,47 |
BR : 1,10
CI50 : 19,09 %
Tableau III
Regroupement de substances chimiques par classe de danger et valeur de CI50
| Substances chimiques | CI50* (15 mm) | WGK** |
|---|---|---|
| Groupe A (de 0,01 à 1,0 mg/l) | ||
| Mercure (HgCl2) | 0,41 | 3 |
| Chloramine-B | 0,58 | 3 |
| Groupe B (de 1,0 mg/l à 100 mg/l) | ||
| Zinc (ZnSO4·7H2O) | 1,92 | 1 |
| 2,4-Dichlorphénol | 2,5 | 3 |
| 1-Naphthylamine | 3,59 | 2 |
| Formaldéhyde | 7,5 | 1 |
| Salicylate de sodium | 18,8 | 1 |
| Phénol | 34,1 | 2 |
| Cuivre (CuSO4·5 H2O) | 47,7 | 2 |
| Groupe C (de 100,0 à 10 000 mg/l) | ||
| Peroxodisulfate d’ammonium | 222 | 2 |
| Triéthylamine | 6 716 | 2 |
| Groupe D (supérieur à 10 000 mg/l) | ||
| Éthanol | 11 301 | 0 |
| 2-Propanol | 19 490 | 1 |
| Méthanol | 43 134 | 1 |
| Sulfate de sodium | 63 383 | 0 |
* : Valeur de la CI50 en mg/l après 15 minutes de temps de contact entre les bactéries Lumistox et l’échantillon.
** : Classe de danger (définie dans le chapitre 19 de « Wasserhaushaltsgesetz »)
0 = Substance non toxique en général 1 = Substance légèrement toxique 2 = Substance toxique 3 = Substance très toxique
Mesure de la CI50
Selon la norme française, le résultat attendu est obtenu sous forme de CI50 à tmin : il correspond à la concentration de l’échantillon, dite concentration inhibitrice, qui en 5, 15 et/ou 30 min inhibe 50 % de la luminescence produite par les bactéries en contact avec l’échantillon. Pour son calcul, les valeurs obtenues, exprimées en pourcentage (taux d’inhibition de la luminescence finale par rapport à la luminescence initiale), sont transformées afin que leur représentation graphique (inhibition en fonction de la concentration ou du pourcentage d’échantillon) soit exprimée sous une forme linéaire. La valeur exacte de la CI50 est calculée à partir de cette courbe. Le Lumistox effectue directement toutes les opérations après la série de mesures. Cependant, la CI50 ne sera mesurée que s’il y a au moins trois valeurs moyennes valables de l’inhibition, comprises entre 10 % et 90 % (tableaux II et III).
Screening test
La mesure de la CI50 n’est pas indispensable pour tous les échantillons. Très souvent, un simple pré-test (screening) permet d’économiser du temps et de l’argent. Pour cela, il suffit de mettre en contact une quantité égale de suspension bactérienne et d’échantillon non dilué. Si l’inhibition de luminescence est inférieure à 20 %, l’échantillon est considéré comme non toxique ; dans ce cas, une CI50 n’est pas nécessaire. Par contre, si l’inhibition est supérieure à 40 %, il y a risque de toxicité et la CI50 est alors obligatoire. Dans les autres cas, l’échantillon risque d’être faiblement toxique et il est alors préférable de procéder à une étude plus approfondie.
Limites du test des bactéries luminescentes : perturbations et solutions
La coloration, la turbidité, tout comme la teneur en sel d’un échantillon, peuvent causer des perturbations ayant pour conséquence une interprétation erronée ou impossible du test.
D’origine marine, la bactérie Vibrio fischeri est sensible à la concentration en sel de son environnement. De ce fait, l’ajout de l’échantillon aux suspensions bactériennes effectué au cours du test ne doit pas comporter le risque d’une variation d’intensité lumineuse due à une modification importante de la salinité. Pour étudier ce phénomène, plusieurs solutions ont été mises au point avec une proportion variable de NaCl (0,5 % à 10 %). Le taux de 100 % de luminescence a été attribué à l’émission de lumière du contrôle contenant en même quantité la solution bactérienne réactivée et une solution aqueuse à 2 % de NaCl (déroulement du test selon la norme française T 90-320). Pour les solutions dont la concentration en NaCl varie de 1,5 % à 4 %, la luminescence due au contrôle est bien retrouvée, soit 100 % ± 5 %. Pour des solutions possédant une concentration en NaCl hors de cette gamme, l’émission de lumière diminue et risque de perturber les résultats du test ; c’est pourquoi il est recommandé d’enrichir en sel un échantillon inconnu. Cependant, si au vu d’analyses complémentaires un taux élevé de sel est suspecté, il est préférable de s’abstenir.
Toute intervention sur l’échantillon altère naturellement ses caractéristiques chimiques, physicochimiques, toxicologiques… C’est pourquoi l’ajout de NaCl sous forme solide à l’échantillon à analyser (2 %) doit être le plus faible possible. De même le pH n’est pas à modifier s’il se situe entre 5,5 et 8,5. Par contre s’il se situe hors gamme, il est nécessaire de le réajuster à la limite la plus proche du domaine de mesure.
Un deuxième critère perturbateur concerne l’état de non-limpidité d’un échantillon ; dans ce cas, la densité des particules peut provoquer une multiplication du rayonnement émis par les bactéries. Le photomultiplicateur enregistre alors un signal lumineux supérieur au signal réellement émis par les bactéries. Une sédimentation, une centrifugation, ou une filtration devraient être les préparatifs obligatoires pour des échantillons troubles avant d’envi
Sager toute analyse de toxicité avec le test des bactéries luminescentes.
Les bactéries Vibrio fischeri émettent de la lumière à 490 nm ; aussi est-il important de déterminer l’influence de la couleur sur la diminution de lumière lorsque la toxicité d’un échantillon coloré est étudiée. Des solutions rouges, bleues et jaunes, salées à 2 % avec du NaCl, ont été analysées : l’ajout de la solution colorée non diluée à la suspension bactérienne aboutissait dans tous les cas à une diminution de l’intensité lumineuse. En utilisant une cuve à doubles parois, il est possible de mesurer l’émission de lumière sans qu’il y ait contact entre les bactéries et les solutions et le même taux d’inhibition a alors été retrouvé, ce qui prouve que l’origine de cette inhibition est due à la couleur et non à la toxicité propre de la solution.
Une dilution permet bien souvent de minimiser la perturbation due à la coloration d’un échantillon. Si cela n’est pas possible, il est utile de se servir de la cuve de correction [5]. Les doubles parois de celle-ci séparent la suspension bactérienne de l’échantillon, chaque solution occupant alors l’une des deux chambres circulaires concentriques distinctes. La mesure de luminescence au moyen de cette cuve spéciale permet le calcul du facteur de correction, lequel, après avoir été déterminé, donne accès à la valeur de l’inhibition réelle due à la seule toxicité. Le taux d’inhibition dû à la couleur peut être également calculé ; cette correction n’annule pas complètement la perturbation, mais elle la corrige suffisamment pour que le résultat recherché puisse être obtenu. Pour un échantillon coloré ayant une absorption comprise entre 450 et 550 nm, il est absolument justifié d’utiliser cette méthode corrective. Cette correction est par exemple tout à fait appropriée à l’étude des sols, pour lesquels l’extraction aboutit souvent à la production d’une solution colorée.
Exemples d’application du test des bactéries luminescentes
La société Xenes [6] a étudié la possibilité d’adaptation du test des bactéries luminescentes au suivi des procédés de décontamination des sols qu’elle a mis au point. Pour définir de manière quantitative le résultat de ses essais, la société a choisi d’évaluer le paramètre de toxicité sous la forme du G₁ [7]. Ce paramètre, peu utilisé en France mais bien connu en Allemagne, détermine pour chaque échantillon la dilution à atteindre pour que l’inhibition de luminescence soit inférieure à 20 % (une valeur de 2 pour un G₁ signifie que l’échantillon étudié est non toxique).
Les sols se différencient d’une part par leur origine géographique et d’autre part par le type et le degré de contamination dont ils sont l’objet. Différents types de sols ont été analysés avec le luminomètre et les bactéries Lumistox. À cet effet, et pour pouvoir mettre en œuvre le test des bactéries luminescentes, un échantillon liquide a été utilisé en vue de simuler au maximum le processus d’élution naturelle des contaminants des sols. Les parties de sol séchées ont subi une extraction aqueuse, puis ont été filtrées ou laissées sédimenter pour éliminer les particules en suspension susceptibles de perturber le test.
Dans le cadre de cette étude, la décontamination d’un sol sablonneux de la région de Larz contaminé par du kérosène a été pratiquée. Le G₁, qui était de 4 avant le début de l’opération, est tombé à 2 en fin de traitement, la concentration du kérosène ayant diminué, comme le G₁.
Le mode d’extraction des sols reste encore du domaine de la recherche. Il n’existe pas en effet de méthode standard définissant cette extraction. G. Karsten [8], dans ses travaux réalisés à l’Université de Bochum, et le Dr R. Pudill [9] arrivent à la même conclusion : l’élution des sols avec une solution contenant un solvant donne la même réponse toxique en utilisant le test des bactéries luminescentes qu’une élution avec de l’eau distillée. De plus, dans ses recherches sur l’adaptation de ce test à la détermination de la charge toxique d’un sol contaminé, G. Karsten démontre que leurs eaux souterraines présentent une toxicité proche de celle déterminée à partir d’éluats aqueux des sols provenant des mêmes lieux géographiques.
Dans son article au sujet de l’évaluation toxicologique des eaux et sols contaminés, H. J. Scheibel [10] a utilisé, pour sa part, une solution aqueuse contenant 2 % de NaCl et 1 % de DMS. Trois sites contaminés ont été étudiés :
- un ancien site de production de gaz, fermé dans les années 70 (Krefeld), contaminé par des hydrocarbures et des hydrocarbures aromatiques polycycliques ;
- le site d’une société chimique, touché principalement par des composés chlorés (Hambourg-Moorfleet) ;
- le site d’une société de recyclage de solvants chimiques.
La détermination de la toxicologie a été menée en parallèle avec deux biotests, le test des bactéries luminescentes et le test des daphnies. Les résultats (CI₅₀ et LD₅₀) livrés par ces deux tests sont comparables et révèlent une haute sensibilité par rapport aux contaminants. De plus, la diminution de la concentration des hydrocarbures lors des mécanismes de décontamination varie en parallèle à la diminution de la charge toxique concernant les bactéries et les daphnies.
Le test des daphnies semble plus simple à mettre en œuvre, mais son application rencontre de grosses difficultés, d’une part en raison du petit nombre de daphnies utilisées, ce qui nécessite une très grande précision dans l’évaluation des daphnies après le temps de contact, et d’autre part dans leur élevage. Par contre, dans le cas du test des bactéries luminescentes, où la concentration des micro-organismes égale 10⁷ cellules/ml dans les cuves de test, ce problème ne se pose pas. De plus, le fait d’utiliser des cuves déjà garnies de bactéries prêtes à l’emploi facilite grandement la tâche.
Conclusion
Le test des bactéries luminescentes prend aujourd’hui sa place parmi les biotests reconnus pour déterminer la toxicité globale des eaux, notamment des eaux résiduaires. Avec le système Lumistox, l’utilisateur possède ainsi un outil efficace et sûr pour réaliser un test de toxicité globale.
Bien que toutes les possibilités de ce test n’aient pas encore été explorées, il répond dès à présent à l’attente de nombreux utilisateurs, que ce soit en opérations de routine ou de recherche.
Nota. La bibliographie de cet article pourra être consultée auprès des auteurs.
