Cet article présente les voies d'utilisation possible de l'analyse PCR des légionelles dans le cadre de la sécurisation des circuits d'eau chaude sanitaire et des tours aéroréfrigérantes. La réponse du signal PCR lors de la mise en oeuvre des traitements de sécurisation généralement utilisés sur les installations (choc thermique, biocides organiques, brome, dioxyde de chlore) n?est pas immédiate et ne reflète pas l'état de contamination des circuits évaluée par la méthode de culture AFNOR réglementaire. Par contre, la PCR est un bon indicateur de l'efficacité d'une sécurisation au chlore appliquée en traitement curatif ou préventif.
Dans le cadre de la gestion du risque sanitaire dans les réseaux d’eau chaude sanitaire (RECS) ou tours aéroréfrigérantes (TAR), la réglementation impose une maîtrise de la concentration en légionelles. Des analyses par culture mettant en évidence des concentrations supérieures aux seuils réglementaires conditionnent la mise en œuvre de traitements préventifs ou curatifs. La mise hors service des installations peut être nécessaire jusqu’au retour à une contamination maîtrisée. L’analyse de référence pour cette problématique consiste à dénombrer le nombre de colonies de légionelles capables de se développer sur un milieu de culture spécifique. Cette analyse normalisée présente cependant plusieurs inconvénients pouvant être un frein pour la réactivité d’intervention des exploitants des réseaux de RECS ou de TAR, en cas de dépassement de valeurs seuils.
- un délai d’analyse long avec un rendu des résultats finaux supérieur à 10 jours, ce qui peut être problématique lors de la gestion de crise,
- le développement de flore interférente dans certains cas d’eau chargée, empêchant le dénombrement des colonies typiques de légionelles sur les boîtes de Petri,
- un manque de spécificité du milieu de culture pouvant fausser la détermination exacte du niveau de contamination.
Afin de réduire le délai du rendu des résultats et améliorer la spécificité de l’analyse, le laboratoire d’analyses de Veolia Environnement (Centre d’Analyses Environnementales : CAE) a développé en collaboration avec Genesystems une méthode de détection des légionelles par PCR quantitative. Cette analyse normalisée depuis 2006 sous la référence XP T 90-471 est effectuée en routine au CAE depuis 2004. Elle consiste à dénombrer les légionelles d’un échantillon donné sur la base de la détection d’un fragment d’ADN. Dans le résultat final sont donc comptabilisées les légionelles viables (cultivables ou non) ainsi que toutes les légionelles non viables dont l’ADN n’a pas été dégradé. Les résultats peuvent être fournis en 24 ou 48 heures.
peu sensible aux problèmes d’inhibition de la réaction.
La PCR L. pneumophila : indicateur du niveau de contamination des circuits ?
La première étape pour évaluer quel pourrait être l’apport de la PCR comme outil de gestion des installations a consisté à vérifier l’existence ou non d’une corrélation avec les résultats obtenus avec la méthode par culture. Un total de 450 échantillons d’ECS et 250 échantillons de TAR ont donc été analysés avec les deux techniques.
Les résultats des analyses par culture sont exprimés en UFC/L (Unité Formant Colonie), ceux de la PCR en UG/L (Unité Génome).
Ces deux courbes montrent que, pris dans leur globalité, il n’y a pas de corrélation entre les résultats obtenus avec les deux méthodes d’analyse. Un résultat négatif par culture ne signifie pas que la PCR va être négative. Par contre, un résultat négatif en PCR est confirmé à plus de 97 % par un résultat négatif en culture. Dans ce cas, la PCR est un bon indicateur de la sécurisation du circuit.
Influence des traitements de désinfection appliqués sur la cultivabilité des légionelles et sur la réponse PCR
Afin d’avoir une vision moins globale et plus détaillée des potentialités de la méthode PCR, l’impact des principaux procédés de sécurisation a alors été observé sur la réponse des analyses par culture et PCR. Ces suivis ont d’abord été effectués en conditions maîtrisées en laboratoire.
Ensuite, les résultats ont été vérifiés.
fiés sur des installations en fonctionnement.
Choc thermique
Le choc thermique fait partie des procédures de sécurisation pouvant être appliquée aux RECS (CSHPF 2001). Il consiste à maintenir pendant 30 minutes minimum une température de 70 °C. Le tableau 1 reprend les résultats obtenus lors d’essais laboratoire ainsi qu'un suivi d'un pilote RECS sur laquelle a été mis en œuvre ce traitement.
Ces essais confirment l'efficacité des chocs thermiques sur les légionelles cultivables, les concentrations étant inférieures après mise en œuvre à la limite de détection de la méthode. Par contre, l’ADN des légionelles n'est pas altéré par ce traitement, les concentrations analysées par méthode PCR étant similaires avant et après choc. Dans ce cas, l’analyse PCR ne peut servir d'indicateur de la bonne efficacité du traitement.
UFC : Unité Formant Colonie
Biocides organiques
Des essais en laboratoire ont ensuite été réalisés en testant différents biocides organiques potentiellement utilisés en choc sur les circuits de TAR (THPS, Isothiazolone, BNPD, PHMB, TBTC). Le tableau 2 présente les résultats de deux essais en batch avec des concentrations de 35 et 50 mg/L en produit commercial. Dans le tableau 3 sont reportées les concentrations analysées lors d’un essai comparatif entre THPS et TBTC avec des doses de traitement de 25 et 50 mg/L de produit commercial.
L'impact sur la cultivabilité des légionelles est différent selon le biocide organique testé. Les analyses montrent que si, pour le THPS, le TBTC, l'Isothiazolone et le BNPD, avec une concentration en produit commercial supérieure à 35 mg/L, aucune légionelle cultivable n'est détectée avec la méthode culturale (soit un abattement supérieur à 2 log) après 6 à 48 heures, la PCR L. pneumophila continue à donner des résultats positifs avec des concentrations proches des valeurs initiales. Les produits biocides testés semblent donc n’altérer que faiblement l'ADN des légionelles.
Le suivi sur plusieurs années d’un site industriel traité uniquement avec trois chocs hebdomadaires, alternativement avec Isothiazolone + Bronopol ou THPS, a permis de confirmer ces résultats (cf. figure 3). Sur ce site industriel, les analyses par culture indiquent une présence régulière de Legionella pneumophila avec des concentrations maximales proches de 10⁴ UFC/L. La réponse de l’analyse PCR L. pneumophila évolue d'une concentration inférieure à la limite de détection (parfois élevée en raison de la présence d'inhibiteurs) à des valeurs comprises entre 10¹ et 10³ UG/L. Cependant, les deux courbes évoluent de manière totalement différente : une contamination en légionelles cultivables peut être détectée alors que les valeurs de PCR sont décroissantes. Il n'y a pas de corrélation possible entre les concentrations de légionelles analysées par les deux méthodes.
Dans le cas de cette installation traitée avec des biocides organiques, le suivi PCR n’apporte pas d'information précise sur l'état de contamination du circuit.
Dioxyde de chlore
Les essais avec dioxyde de chlore ont été effectués uniquement lors d’essais en batch. Le tableau 4 reprend les résultats obtenus lors de ces différents tests.
Ces résultats montrent une bonne efficacité du dioxyde de chlore sur les légionelles. Avec un traitement à 1 mg/L, les analyses par culture effectuées après une heure de temps de contact donnent des résultats inférieurs au seuil de détection. La cinéti-
UG : Unité Génome
Tableau 4 : Impact d’un traitement au dioxyde de chlore sur la concentration en légionelles (méthodes culture et PCR)
| Essai 1 |
|---|
| L. pneumophila ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumophila ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : ND / 103 000 |
| • ClO₂ 1 mg/L – t = 1 h : < 50 / 17 333 |
| • ClO₂ 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / < 50 |
| Essai 2 |
| L. pneumophila ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumophila ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 2 100 / 49 333 |
| • ClO₂ 1 mg/L – t = 1 h : < 50 / 12 966 |
| • ClO₂ 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / 1 550 |
UFC : Unité Formant Colonie – UG : Unité Génome
Que l’action du dioxyde de chlore sur l’ADN des légionelles est beaucoup plus lente : après 8 heures de temps de contact, les résiduels sont encore supérieurs à la limite de quantification.
La réponse PCR, dans le cas de l’utilisation du dioxyde de chlore, ne représente pas l’efficacité du traitement telle que mise en évidence avec les analyses par culture.
Brome
Le brome constitue l’oxydant le plus fréquemment employé dans le cadre de la sécurisation des tours aéroréfrigérantes. Les résultats des essais laboratoire sont repris dans le tableau 5. Les concentrations en brome sont exprimées en équivalent chlore libre.
Tableau 5 : Impact du brome sur la concentration en légionelles (méthodes culture et PCR)
| Essai 1 |
|---|
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 4 500‒5 400 / 66 333 |
| • BrO₂ 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / 3 100 |
| Essai 2 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 2 600 / 2 400 |
| • BrO₂ 1 mg/L – t = 4 h : < 50 / 14 000 |
| • BrO₂ 1 mg/L – t = 24 h : < 50 / < 830 |
| • BrO₂ 5 mg/L – t = 24 h : < 50 / < 830 |
| Essai 3 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 25 000 / 14 000 |
| • BrO₂ 0,5 mg/L – t = 24 h : 12 500 / 24 000 |
| • BrO₂ 1 mg/L – t = 24 h : 7 020 / 22 000 |
| • BrO₂ 1,2 mg/L – t = 24 h : < 50 / < 1 700 |
UFC : Unité Formant Colonie – UG : Unité Génome
Ces résultats montrent une cinétique d’inactivation des légionelles avec le brome assez lente. Après 4 heures, avec une concentration jusqu’à 5 mg/L, les analyses par culture montrent un abattement des légionelles inférieur à 1 log. Les prélèvements effectués par la suite à 8 h ou 24 h indiquent l’absence de légionelles viables et cultivables sur l’ensemble des échantillons traités.
L’analyse des légionelles par méthode PCR met en évidence une cinétique de décroissance plus lente que celle relevée avec la méthode culturale. Après 4 heures, les valeurs de concentration restent similaires à celles initiales. La présence d’ADN de légionelles continue à être analysée sur plusieurs échantillons par la suite alors que l’analyse par culture indique l’absence de bactéries cultivables. Le temps nécessaire pour descendre en deçà du seuil de détection par la méthode PCR est supérieur à celui relevé pour ne plus avoir de bactéries cultivables.
Dans le cas de l’utilisation de brome, l’analyse PCR des légionelles ne donne pas une image précise du niveau de sécurisation tel qu’analysé avec la méthode par culture.
Chlore
Le chlore est l’oxydant le plus fréquemment mis en œuvre sur les RECS ainsi que sur les TAR, soit lors d’opération curative, soit comme traitement de fond de manière préventive. Le tableau 6 présente les résultats des essais laboratoires réalisés dans des conditions simulant ces deux possibilités.
Tableau 6 : Impact du chlore sur la concentration en légionelles (méthodes culture et PCR)
| Essai 1 |
|---|
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : < 50 / 103 000 |
| • Chlore 50 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 3 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / < 667 |
| • Témoin – t = 8 h : < 50 / < 667 |
| Essai 2 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 2 100 / 49 333 |
| • Chlore 50 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 3 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / < 667 |
| • Témoin – t = 8 h : 2 500 / 69 700 |
| Essai 3 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 4 500‒5 400 / 66 333 |
| • Chlore 50 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 3 mg/L – t = 1 h : < 50 / < 667 |
| • Chlore 1 mg/L – t = 8 h : < 50 / < 667 |
| • Témoin – t = 8 h : 4 500 / 32 700 |
| Essai 4 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 2 600 / 2 400 |
| • Chlore 1 mg/L – t = 4 h : < 50 / < 830 |
| Essai 5 |
| L. pneumo ‒ Culture (UFC/L) / L. pneumo ‒ PCR (UG/L) |
| • Échantillon initial (t0) : 25 000 / 14 000 |
| • Chlore 0,5 mg/L – t = 4 h : 400 / < 1 700 |
UFC : Unité Formant Colonie – UG : Unité Génome
Les analyses montrent une contamination du circuit en permanence proche de 10⁴ UFC/L sur plusieurs mois par méthode culturale et sensiblement équivalente avec la méthode PCR (10⁴ UG/L).
Tous les échantillons prélevés après la mise en œuvre du traitement en continu au chlore présentent des concentrations inférieures au seuil de détection aussi bien dans le cas de l’analyse par culture que dans le cas de l’analyse PCR, à l’exception de la première analyse qui donne un résultat inférieur au seuil de quantification.
Dans tous les cas, aucune concentration mesurable n’a été détectée après le démarrage de la sécurisation, ce qui confirme les résultats obtenus lors des essais laboratoire.
Ces résultats montrent que les légionelles sont très sensibles à la chloration. Les concentrations analysées par méthode culturale chutent rapidement : dès une heure de temps de contact, aucune légionelle cultivable n’est analysée avec un taux de traitement de 1 mg/L et plus et un abattement proche de 2 log est obtenu avec 0,5 mg/L. En parallèle, les valeurs de PCR décroissent également très rapidement : tous les échantillons analysés indiquent des concentrations toujours inférieures à la limite de quantification et généralement inférieures à la limite de détection de la méthode PCR.
Le chlore semble avoir une action sur l’ADN des légionelles. Dans les conditions de traitement usuellement appliquées sur site, l’analyse PCR devient alors un bon indicateur du niveau de sécurisation du circuit. Ces observations sont confirmées par le suivi de deux sites sur lesquels une sécurisation au chlore a été mise en œuvre.
Le premier site concerne un réseau d’eau chaude sanitaire présentant une contamination régulière en légionelles (cf. figure 4).
Les analyses montrent une contamination du circuit en permanence proche de 10⁴ UFC/L sur plusieurs mois.
Les concentrations en légionelles sur un circuit de TAR industrielle ont également été suivies pendant plusieurs mois. La stratégie biocide appliquée a été modifiée pendant cette période et les résultats sont présentés sur la figure 5.
Sur ce site, la stratégie de sécurisation consistait initialement en un traitement continu au brome couplé à une injection régulière de biocide organique. Pendant toute cette période, aucun point positif en légionelles n’a été observé lors des analyses par culture. Les niveaux en PCR L. pneumophila fluctuent entre des valeurs inférieures au seuil de détection et des concentrations proches de 10⁴ UG/L.
Après remplacement du brome par le chlore, et avec des conditions de fonctionnement similaires, les analyses par culture confirment la bonne sécurisation du circuit. Les analyses PCR L. pneumophila donnent alors des résultats en permanence inférieurs à la limite de détection de la mesure, confirmant également les observations des essais laboratoire.
Domaine d’utilisation de la PCR L. pneumophila
Les différents essais exposés précédemment montrent qu’il n’existe pas de corrélation directe entre les résultats d’analyses légionelles par culture qui doivent respecter les seuils réglementaires et ceux des analyses PCR qui ne sont pas pris en compte par la réglementation. Seuls les résultats en PCR inférieurs à la limite de détection signifient que l’analyse par culture donnera également un résultat inférieur à la limite de détection.
Les diverses expériences menées en laboratoire ainsi que les résultats des retours d’expérience sur différents RECS et TAR montrent que les différentes solutions mises en œuvre pour la sécurisation des circuits n’impactent pas de la même manière la réponse PCR même si les ana-
lyses par culture montrent l’efficacité du traitement. Les chocs thermiques (70 °C, 30 minutes) n’ont qu’un effet très limité. Les cinétiques de dégradation de l’ADN des légionelles lors de chocs biocides ainsi que lors de traitement avec dioxyde de chlore ou brome sont plus faibles que celles obtenues en suivant la décroissance des légionelles cultivables dans l’échantillon. Dans ces cas-là, l’analyse PCR ne peut être un indicateur d’efficacité des traitements. Cependant, la PCR peut représenter un outil intéressant pour les exploitants dans la gestion des circuits lors d’opération de sécurisation au chlore. En effet, les essais en laboratoire ainsi que les retours d’expérience confirment l’impact du chlore sur l’ADN des Legionella pneumophila. Dans ce cas-là, l’efficacité du traitement est prouvée par des résiduels en légionelles inférieurs à la limite de détection les méthodes par culture et par PCR.
Tous ces résultats montrent que les différents procédés de désinfection testés ont un mécanisme d’action différent sur les légionelles. En effet, la perte de cultivabilité n’est pas forcément associée à une dégradation de l’ADN des bactéries.
Afin d’élargir le domaine d’utilisation de la PCR, des études sont actuellement menées pour développer des systèmes ciblant les bactéries viables. Ainsi, des travaux récents mentionnent l’utilisation d’agents intercalants capables de pénétrer dans les cellules non-viables et d’inhiber l’amplification de l’ADN de ces cellules. L’adaptation de ces méthodes à la détection des légionelles viables ouvre des perspectives prometteuses dans l’évaluation des niveaux de sécurisation des circuits ainsi que de l’efficacité des procédures de désinfection.
Références bibliographiques
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