La mesure de l'ATP intracellulaire : indicateur pertinent de la qualité de l'eau des circuits de refroidissement

D’autres indicateurs peuvent également être utilisés pour rapidement identifier l’apparition d’un facteur de risque avant même que n’apparaissent les légionelles. Quel que soit cet indicateur, il est impératif d’abord de connaître la signification de la mesure pour qu’il devienne un outil décisionnel pertinent et efficace. La mesure d’ATP intracellulaire sur trois installations de refroidissement permet de détecter rapidement une dérive de l’activité microbienne dans l’eau et d’en rechercher l’origine dans des conditions d’utilisation définies. Cette interprétation dépend de la qualité d’eau, de la stratégie de traitement et de l’état du biofilm dans l’installation. Comme tout autre résultat d’analyse, il est nécessaire de les interpréter par l’exploitant et ils ne valent que pour l’installation correspondante.

Les installations de refroidissement humides équipées de tours aéro-réfrigérantes sont les systèmes de refroidissement les plus performants. Elles présentent toutefois un inconvénient majeur, celui de pouvoir émettre des aérosols contaminés par des légionelles. En effet, les légionelles peuvent contaminer l’eau en circulation de manière aléatoire à partir du biofilm qui se forme sur les parois des circuits des installations. La prise en compte de ce risque microbiologique est impérative lors de l’exploitation de ce type d’installation. Le plan d’entretien permet d’identifier les différents moyens à mettre en œuvre dans de tels cas afin de limiter les facteurs de risque qui conduisent à l’appa-

La répétition de fortes concentrations en légionelles dans l'eau du circuit. L’efficacité de ces moyens est contrôlée au moyen d’un plan de surveillance qui définit les indicateurs dont la dérive par rapport à une valeur cible témoigne d'une perte de contrôle.

Usuellement la variation de l’indicateur légionelle au-delà de 10³ UFC/L de manière récurrente et incontrôlée traduit une perte ou une absence de maîtrise du système. Mais d'autres indicateurs peuvent également être utilisés pour s’assurer de la performance de la stratégie de traitement. L’intérêt est de détecter le plus rapidement possible un désordre, avant même que des légionelles soient dénombrées dans l’eau en forte concentration.

Pourtant, les différentes méthodes d’analyse ne mesurent pas la même chose dans l’eau : leurs résultats ont une signification propre qui doit être comprise avant de décider des actions de traitement à mettre en œuvre (1). Ainsi, la dérive de certains indicateurs ne devrait pas conduire de manière systématique à une désinfection curative si elle ne traduit pas la présence avérée de légionelles en forte concentration. Les désinfections répétées polluent l’environnement et induisent un autre risque sanitaire en protégeant les légionelles au sein de certains genres d’amibes résistants (2).

L’ATP-métrie est un exemple de ces indicateurs disponibles : il n’est pas directement corrélé à la présence de légionelles dans l'eau, mais mesure l’Adénosine TriPhosphate, une molécule de stockage d’énergie présente dans tous les organismes vivants (4). Le résultat de cette mesure traduit donc l’activité microbienne globale dans le volume d’eau représenté par l’échantillon. L’intérêt de cet indicateur est de permettre une mesure sur site et de fournir un résultat immédiat (3). Cet article a pour objet de présenter les résultats d'études conduites sur trois installations et de montrer sous quelles conditions l'indicateur ATP peut être un outil de surveillance pertinent pour gérer le risque de prolifération des légionelles dans les installations de refroidissement humides.

Tableau 1 : Description des installations étudiées

Matériel et méthode

Installations et caractéristiques physico-chimiques

Trois installations, utilisées pour évacuer la chaleur d'un réseau d'eau, sont étudiées (tableau 1).

Deux d'entre elles, Opéra-Galfa et Halles, sont des circuits complexes de taille et de volume moyen :

• Le site Opéra-Galfa est composé de six tours alimentées par le circuit Opéra et de quatre tours alimentées par le circuit Galfa. Les tours refroidissent l'eau provenant de neuf machines frigorifiques. Ces deux circuits initialement séparés ont été raccordés par deux canalisations.
• Le site Halles comporte dix tours équilibrées entre elles et refroidissant l'eau provenant de dix machines frigorifiques.

La troisième installation, dite installation pilote, est de conception très simple et de volume plus faible.

Les caractéristiques physico-chimiques des différentes installations sont reportées dans le tableau 2. À noter que ces trois installations sont alimentées par de l’eau potable en appoint.

La stratégie de traitement pour lutter contre le risque légionelle est la même sur les circuits Halles et Opéra-Galfa. Elle est basée sur une action permanente visant d'une part à maintenir l’épaisseur du biofilm minimale en tous points de l'installation (action chimique et mécanique, notamment par une circulation régulière de tous les volumes d'eau : chaque pompe de l'installation est mise en service toutes les 24 h pendant une durée d’une heure) et, d’autre part, à limiter les légionelles dans l'eau au moyen d'une désinfection oxydante. Aucune désinfection en choc biocide non oxydant n'est utilisée.

L’installation pilote est une installation de recherche et développement exploitée dans des conditions réelles. Seul le ventilateur est maintenu à l’arrêt pendant la durée des essais, afin de permettre la dérive des paramètres de suivi sans générer de risque de dispersion d’aérosols. Au moment de la mise en service de l'installation, seuls les traitements anticorrosion-antitartre de l'eau ont été mis en œuvre. Différentes stratégies de traitement ont ensuite été testées (traitements en choc, nettoyage continu). La qualité d'eau est suivie par la mesure de plusieurs paramètres indicateurs, dont les légionelles viables, cultivables et le cATP.

Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques des installations

Mesures

Mesures de l'ATP intracellulaire (cATP)

Le kit Quench-Gone™ Aqueous (QGA™), commercialisé par Aqua-tools, a été utilisé. Le principe de la mesure de l’ATP repose sur la bioluminescence. Cette mesure est effectuée grâce à l'enzyme luciférase qui catalyse la réaction entre la luciférine (substrat), l'ATP (cofacteur) et l’oxygène, ce qui entraîne une émission de lumière. Chaque molécule d’ATP consommée dans la réaction produit un photon de lumière. La quantité de lumière produite est directement proportionnelle à la quantité d’énergie biologique présente dans l’échantillon. Le kit QGA™ mesure uniquement l’ATP intracellulaire (cATP), contenu dans les microorganismes vivants. L’ATP extracellulaire, libéré par des microorganismes morts et qui pourrait être encore intact...

La mesure d’ATP-métrie peut être mise en œuvre in situ : le filtrat d’un échantillon d'eau (50 ml), dont les bactéries filtrées ont été lysées, afin de libérer leur ATP intracellulaire, est mis en solution avec la Luciférase. La quantité de photons émis est alors mesurée avec un Luminomètre. Grâce à une solution étalon d’ATP, cette mesure est convertie en concentration et exprimée en pg/mL.

Légionelle par culture

Un échantillon d’eau de 1 litre représentatif du volume d'eau en circulation dans l'installation est prélevé dans un flacon stérile contenant du 0,5 % de thiosulfate. Les échantillons sont traités en laboratoire au maximum 3 heures après le prélèvement. Le dénombrement des légionelles viables cultivables est réalisé selon la méthode NF T 90 431.

Prélèvement

Les prélèvements pour analyses des légionelles viables cultivables sont réalisés en un point du circuit où l'eau prélevée est représentative de l'ensemble de l'installation en circulation.

Pour les analyses de cATP, plusieurs prélèvements d'eau sont effectués en différents points de l'installation, afin d’en vérifier l'homogénéité.

Des échantillons provenant de 18 zones pour le site Opéra-Galfa et 28 pour le site Halle, dont 3 sur les appoints (eau de ville avant suppresseur, eau sortie adoucisseur, eau avant appoint des tours) ont été analysés. Les prélèvements sont effectués pompes à l'arrêt puis 1 heure après leur mise en service.

Sur le circuit pilote, cinq points de mesure ont été définis pour les mesures de cATP : eau d’appoint, eau dans le bac de la tour, eau du « circuit » en aval de la tour juste après la pompe de circulation, en amont et en aval de l’échangeur.

Résultats, discussion

Résultats des mesures sur le site pilote

Dans la première partie de l'étude, la stratégie de traitement prévoit de laisser s'installer le biofilm. Puis, dans une deuxième partie, des injections chocs de tensioactifs et de biocides non oxydants sont réalisées (figure 3).

Legionella spp cultivable est détectée après la 6ᵉ semaine d’étude (2,2 × 10² UFC/L) puis reste inférieure à la limite de détection. C’est une injection accidentelle de tensioactif qui, en agissant sur le biofilm, induit l'augmentation des Legionella spp cultivables (augmentation de 3 log). Cette contamination de l'eau restera alors permanente (entre 2 × 10² et 2 × 10⁴ UFC/L).

Les analyses par culture traduisent de façon évidente le risque induit par une injection de tensioactif en choc. Les légionelles du biofilm passent en circulation dans l'eau.

Le passage de légionelles en forte concentration dans l'eau à partir du biofilm présent dans le circuit ne se traduit pas par une augmentation de l'activité microbienne.

Toutefois, sur cette installation, les résultats des mesures cATP apparaissent très variables, ce qui traduit une grande instabilité de la qualité d’eau.

La recherche de l’origine de cette instabilité a conduit à la mesure du cATP en différents points de l'installation.

La cartographie ainsi réalisée exclut la présence d'un bras mort, qui pourrait expliquer cette instabilité de la mesure cATP par contamination aléatoire (figure 1). En revanche, les mesures effectuées sur l'eau d'appoint (eau de ville) montrent une activité biologique bien supérieure aux valeurs obtenues sur Paris et région parisienne en eau de ville potable (entre 0,3 et 2 pg cATP/mL). La médiane des 85 mesures est de 7 pg cATP/mL, mais les mesures montrent que cette valeur peut être de l'ordre de 44 pg cATP/mL. Ces résultats permettent d’identifier un problème de qualité sur l’eau d’appoint (figure 2).

La conception du réseau d’eau d’appoint crée un bras mort maintenu à température tempérée. Bien que les concentrations en légionelles viables cultivables soient inférieures à la limite de détection, les analyses complémentaires ont révélé la présence de fortes concentrations d’amibes.

Ainsi, le cATP a permis de mettre en évidence une dégradation de la qualité de l'eau d’appoint. Il est indispensable d’éliminer ce problème pour une gestion de risque efficace, sûre et moins onéreuse sur le circuit. Cela n’a pas été possible sur l’installation pilote pendant la durée de l’étude.

Les désinfections en chocs avec des biocides non oxydants induisent une réduction du dénombrement des légionelles viables cultivables. Après le premier choc, la concentration décroît. Mais elle retrouve sa valeur initiale rapidement.

C’est seulement après le quatrième choc au DBNPA que leur nombre décroît significativement (environ 2 log). Toutefois, l’abattement n’est pas suffisant pour maîtriser la concentration inférieure à 10³ UFC/L. L’isothiazolone apparaît plus efficace puisqu’il induit un abattement en légionelles viables cultivables plus important (–3 log Legionella spp.). Les analyses sont ensuite inférieures à la limite de détection.

Le cATP semble traduire la même tendance mais reste difficile à interpréter sur une telle installation, instable du fait de l’eau d’appoint fortement dégradée.

Imprévus de l’installation ont conduit à une dérive des paramètres indicateurs. Il est intéressant de noter que le cATP indique une tendance vers la hausse de l’activité microbienne avant que n’apparaissent les légionelles viables cultivables dans l’eau. Le retour d’expérience sur ce type d’installation (process associé, qualité d’eau) montre que la ligne de base pour le cATP se situe autour de 100 pg/ml. Dans cette phase d’étude encore, les résultats traduisent toujours le caractère instable et dégradé de l’eau d’appoint.

Dès l’injection de tensioactif en permanence (phase de nettoyage chimique et mécanique), la concentration en légionelles viables cultivables augmente dans l’eau circulante puis diminue progressivement (figure 4). Pour favoriser l’élimination des microorganismes, des désinfections en choc avec l’isothiazolone suivies de vidanges partielles sont effectuées. Ainsi, les mesures en légionelles viables cultivables deviennent inférieures à la limite de détection, ce qui illustre le début de la phase stabilisée.

L’activité microbienne évolue dans le même sens. Le cATP diminue progressivement jusqu’à la phase stabilisée.

Durant cette phase, des mesures stables permettraient de déterminer la ligne de base au-delà de laquelle toute dérive traduirait un désordre dont il faudrait rechercher l’origine. Mais dans cette étude, des arrêts

Mesures des eaux d’appoint des sites Opéra-Galfa et Halle

La qualité de l’eau de ville sur le site Opéra-Galfa est correcte (0,79 pg cATP/ml). Le site Halle est légèrement au-dessus avec 2,58 pg cATP/ml (tableau 3). Une inspection de l’installation d’acheminement de l’eau de ville après compteur devra être réalisée pour vérifier la conception qui pourrait expliquer la dégradation de sa qualité.

En sortie d’adoucisseur, la concentration en cATP est trois fois plus importante, ce qui peut s’expliquer par le fait que les adoucisseurs sont des nids à bactéries. Cependant dans ce cas, il est possible de vérifier que l’eau adoucie en amont des tours sur le site Opéra-Galfa, prélevée au 8ᵉ étage en terrasse (alors que les adoucisseurs sont situés au niveau du 6ᵉ sous-sol), reste correcte (2,28 pg cATP/ml).

L’augmentation de la biomasse au niveau des adoucisseurs n’est pas anormale. Il est seulement important de retenir que les adoucisseurs sont des niches de proliférations microbiologiques. Il convient donc, au minimum en cas d’arrêt prolongé, de provoquer un rétro-lavage avant remise en service. Ce résultat justifie qu’un entretien annuel soit recommandé.

Tableau 3 : résultats des mesures cATP sur l’appoint des sites Halle et Opéra-Galfa

Cartographie site Opéra-Galfa

Les 15 prélèvements montrent une bonne homogénéité de l’eau, avec une activité microbiologique < 1 pg cATP/ml dans l’ensemble de l’installation Opéra-Galfa. La mise en service de toutes les pompes pour

assurer la circulation régulière de tous les volumes d’eau n’affecte pas les résultats de manière significative.

Cartographie site Halle

Les différents prélèvements répartis sur les 25 zones du site Halle montrent une bonne homogénéité, environ 50 pg cATP/ml en tous points du circuit à l’exception de l’entrée et sortie du GF1 (321 et 292 pg cATP/ml respectivement).

Suite à une panne de pompe, le groupe froid n° 1 (GF1) constituait un « bras mort » fonctionnel. L’activité microbiologique est en conséquence plus active.

Il est bien entendu que l’intérêt de la mesure de cATP n'est pas d’identifier l’arrêt prolongé d’une pompe, mais ces résultats montrent que sur une installation en phase stabilisée (stable avec gestion du biofilm), une zone anormale d’activité microbiologique peut être décelée. La moyenne des résultats cATP obtenus sur le site Halle sont 47 à 70 fois plus élevés que ceux du site Opéra-Galfa. Sur ces deux circuits, l’historique des mesures de légionelles viables cultivables montre des résultats inférieurs à la limite de quantification en permanence. Cela démontre que les interprétations de résultats des mesures cATP ne sont valables que site par site, et en aucun cas transposables à une autre.

Comme sur le site Opéra-Galfa, la mise en service des pompes ne modifie pas les résultats de manière significative.

[Tableau 4 : Influence du temps sur les résultats des mesures cATP des sites Halle et Opéra-Galfa (résultats GF1 site Halle exclus)

Conclusions

L’ATP intracellulaire est un indicateur utile car il peut permettre de détecter rapidement une zone de dégradation de la qualité de l'eau. L’augmentation de la valeur du cATP de manière anormale traduit en effet une activité biologique intense, susceptible d’être favorable à la formation de biofilm. Sur une installation en phase stabilisée, le cATP pourra alors indiquer, bien avant la culture de légionelles, l’apparition d’un facteur de risque sur l’installation. En revanche, il sera très variable sur une installation où le biofilm, non maîtrisé, libère ponctuellement des légionelles dans l'eau.

Le résultat de la mesure de cATP, comme pour tout autre résultat d’analyse, doit se lire avec des éléments d’information sur le circuit (qualité d’eau, stratégie de traitement, état du biofilm) et doit nécessairement être interprété par l’exploitant. Il ne vaut que pour l’installation correspondante.

Références bibliographiques

* Merchat M. « Représentativité et pertinence des outils sur les circuits de refroidissement » plateforme légionelle, AFNOR, 16 décembre 2008.

* Deumier A., Chaperon G., Merchat M. « Évaluation de l'efficacité des désinfections biocides en choc dans les installations de refroidissement » rapport d'étude Ineris, 2006.

* Carine Magdo, Altis Semiconductor ; « Maîtrise du risque Legionella : mise en place d'un suivi de la biomasse active par ATP-métrie sur des circuits de refroidissement » TSM, numéro 11, 2008.

* Marc Raymond « Utilisation du kit Quench Gone Aqueous™ comme outil d'aide à la mise en place d'une Analyse Méthodique des Risques et de plans de surveillance des réseaux » Colloque National Legionella et Légionelloses, octobre 2007.