Kits immuno-enzymatiques pour la détection rapide des hydrocarbures dans les sols

Les kits immuno-enzymatiques sont basés sur le principe de l’essai d’immunoabsorption d’enzyme lié (ELISA). Ils offrent aux ingénieurs, chargés de la décontamination des sites, un nouvel outil permettant une meilleure gestion de cette dernière. Certaines sociétés d’ingénierie, travaillant dans le secteur de l’environnement, utilisent d’ailleurs les données analytiques accumulées dans les différentes études.

Les résultats analytiques fournis par les kits immuno-enzymatiques, dans le cadre d’analyses d’un polluant unique ou d’un mélange simple, de plusieurs contaminants, ne présentent pas de difficulté particulière dans leur interprétation. Par contre, cette interprétation peut devenir plus délicate dans le cas de mélanges complexes de certains composés, comme les hydrocarbures aromatiques, trouvés sur les sites contaminés par des carburants pétroliers.

La méthode des hydrocarbures totaux est la méthode habituellement utilisée pour évaluer la contamination liée à des produits dérivés de carburants. C’est la méthode d’évaluation quantitative de la concentration d’une gamme très large d’hydrocarbures pétroliers associés aux produits combustibles. Les résultats sont alors exprimés en ppm d’hydrocarbures totaux pour chaque échantillon analysé.

Les dérivés pétroliers des carburants sont des mélanges complexes d’hydrocarbures, de composition variable suivant la source du pétrole brut et le procédé de raffinage utilisé. Les caractéristiques chimiques des carburants peuvent varier suivant la marque et le grade de ceux-ci, et dépendent du processus de dégradation de l’hydrocarbure, de la zone géographique impliquée dans la pollution, de la source commerciale de l’hydro-

Il existe deux normes françaises pour l’analyse des hydrocarbures dans les eaux :

• • La norme T90-114 pour le dosage des hydrocarbures totaux, méthode par spectrométrie infrarouge. Cette méthode est applicable aux eaux pour lesquelles la teneur en hydrocarbures est supérieure à 0,5 mg/kg. Dans cette norme, on entend par hydrocarbures totaux les produits hydrocarbonés extractibles par le tétrachlorure de carbone en milieu acide, non retenus sur l'agent adsorbant spécifié dans la présente norme et donnant un maximum d’absorption dans la région de 3290 à 3510 nm.
• • La norme T90-115 pour le dosage de six hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP. Ces derniers sont le Fluoranthène, le Benzo[a]pyrène, le Benzo[b]fluoranthène, le Benzo[ghi]pérylène, le Benzo[k]fluoranthène et l'Indéno[1,2,3-cd]pyrène.

Kits immuno-enzymatiques pour « screening »

La plupart des kits ELISA, disponibles sur le marché, sont spécifiques à une famille donnée de polluants, c’est-à-dire qu’ils sont réactifs à un certain type de structure chimique. Les deux kits les plus communément utilisés, actuellement, permettent l’analyse :

• • des hydrocarbures mono-aromatiques ou aromatiques légers (« BTEX » ou « TPH »),
• • les composés constitués de trois, quatre voire cinq noyaux aromatiques ou aromatiques polycycliques (« HAP » ou « KAP »).

Il est, par ailleurs, désormais possible de déterminer une troisième catégorie : les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) cancérigènes, plus lourds, avec les kits RaPID Assays Ohmicron.

Les carburants pétroliers sont toujours constitués de mélanges de composés aromatiques individuels, incluant des chaînes aliphatiques normales, des aromatiques légers (toluène, naphtalène et les xylènes présents dans des essences très raffinées) ainsi que des aromatiques moins volatils (le phénanthrène, l’anthracène et le benzo[a]pyrène présents dans les diesels et les fuels domestiques).

Il n’est pas rare qu’un opérateur, ne connaissant pas la technologie des immunoessais, s’attende à trouver des résultats exprimés directement en termes d’hydrocarbures totaux. En fait, les résultats obtenus doivent être plutôt compris comme représentant des index numériques qu’il faudra calibrer.

Comparaison des méthodes

Afin d’aider les utilisateurs de kits immuno-enzymatiques, Ohmicron a étudié la relation de corrélation pouvant exister entre les résultats trouvés par les méthodes officielles d’analyse des hydrocarbures totaux et les résultats obtenus par les kits ELISA. Les essais ont été effectués sur des échantillons contenant des mélanges d’hydrocarbures volatiles (BTEX totaux) et des hydrocarbures aromatiques polycycliques semi-volatils (HAP).

Les méthodes officielles, auxquelles il est fait référence dans ce texte, sont des méthodes américaines, reconnues par l’organisme de protection de l’environnement (EPA) existant dans ce pays. Ces méthodes sont :

• • la méthode par chromatographie gazeuse (8015M) calibrée à l’aide d’un carburant de concentration connue. Un carburant à base de diesel et un autre à base d’essence furent utilisés pour la calibration. Les résultats sont exprimés en ppm. Les échantillons inconnus furent classifiés suivant leur provenance comme dérivés d’essence ou de diesel, afin d’appliquer une calibration correcte.

Le kit ELISA « BTEX totaux » fut calibré à l’aide d’une solution stable équivalente à un mélange en parts égales de benzène, toluène, éthylbenzène et des trois isomères du xylène. Cela signifie qu’un résultat égal à 1 ppm de « BTEX total » correspond à une réponse équivalente à la réponse obtenue avec 1 ppm de chacun des six composés aromatiques, ci-dessus mentionnés, lorsque tous sont présents dans l’échantillon.

Le RaPID Assay « HAP » fut calibré à l’aide d’une solution équivalente à une préparation analytique pure de phénanthrène.

Vue la diversité des matériaux de calibration et des procédés analytiques utilisés, une comparaison, en lecture directe, à la

méthode 8015M n'était pas envisagée. Cependant une relation numérique stable entre les différentes méthodes était attendue.

La Figure 1 montre les résultats obtenus avec les kits « BTEX totaux » et « HAP » dans le cas d'analyses d'échantillons d'essence, à différentes concentrations.

Une relation linéaire (r = 0,98) est observée entre les résultats obtenus avec le kit « BTEX totaux » et les résultats obtenus par la méthode officielle.

Le kit « HAP » n’a eu que très peu de réactivité avec l’essence.

La Figure 2 permet d’observer une forte corrélation existant entre la réactivité des kits « BTEX totaux » et « HAP », dans le cas d'un échantillon de diesel, et la méthode officielle.

Le kit « HAP » détecte les aromatiques les plus lourds et montre une relation existant dans un rapport allant d’environ 1 (kit « HAP ») à 12 (méthode chromatographie) et un coefficient de régression linéaire r = 0,98.

Le kit « BTEX totaux » réagit également fortement avec le diesel. Cela est probablement dû à la présence, non négligeable en quantité, de naphtalène dans l’échantillon. Pour ce dernier kit le rapport 1 (kit « BTEX totaux ») à 6 (méthode officielle) et un coefficient de corrélation de 0,98 est obtenu. Chacun de ces deux kits peut donc être utilisé pour un diesel ayant des caractéristiques similaires à celui étudié ici, avec une concentration supérieure ou égale à 25 ppm. Le kit HAP est plus sensible.

La méthode officielle américaine 418.1 (spectroscopie infrarouge) fut ensuite utilisée pour détecter la présence d’hydrocarbures dans un ensemble de trois échantillons inconnus d’essence et de diesel. Des étalons à 100 % d’essence et de diesel furent utilisés pour calibrer la méthode.

La méthode 418.1 utilise le fréon comme solvant (et non le tétrachlorure de carbone, comme en France).

La figure 3 compare les résultats obtenus, sur les deux types de carburants, à l’aide du kit « BTEX totaux » à ceux obtenus avec la méthode 418.1.

Si l'on applique une régression linéaire aux résultats provenant des échantillons d’essence, on constate que les valeurs obtenues à l’aide de la méthode 418.1 sont 3,5 fois plus élevées que celles obtenues à l’aide du kit ELISA (r = 0,99).

Pour le diesel, les valeurs obtenues à l'aide de la méthode 418.1 sont 2,8 fois supérieures (r = 0,96).

Le kit « HAP », utilisé sur le diesel, fournit des valeurs dans un rapport allant de 1 (pour le kit) à 7 pour la méthode infrarouge, avec un coefficient de corrélation de 0,97.

Interprétation des résultats

Les informations de corrélation, fournies ci-dessus, démontrent l’utilité des méthodes immuno-enzymatiques pour des domaines d'analyse où jusqu’alors n’étaient utilisées que des méthodes officielles (chromatographie gazeuse ou spectroscopie infrarouge). Bien sûr, il ne faut pas utiliser les résultats bruts, donnés ci-dessus, directement sur d'autres échantillons. En fait, nous suggérons, afin d’obtenir de meilleurs résultats, de pré-tester un échantillon du sol à nettoyer en étudiant la relation de corrélation existant, sur cet échantillon, entre la méthode officielle et le kit ELISA. Chaque carburant possède une composition particulière qui influence différemment les anticorps du kit immuno-enzymatique.

Une essence usagée donnera une réponse plus forte avec le kit ELISA que la même essence fraîche. Lorsque les composés les plus volatils, comme le benzène, s’évaporent du milieu, les anticorps détectent un plus fort ratio de composés moins volatiles, tels les xylènes et le naphtalène, auxquels ils sont alors plus sensibles. Un échantillon d’essence standard laissé dans un réservoir ouvert à l'air réagira deux fois plus fortement, au kit « BTEX totaux », 24 heures après.

Conclusion

Utilisés correctement, les tests de « screening » immuno-enzymatiques constituent des outils puissants pour la réhabilitation des sites pollués. Une bonne compréhension,

par les utilisateurs, de la technologie ELISA et des différences existant entre cette méthode d'analyse et les méthodes qu'ils ont pu utiliser dans le passé, ne peut être que bénéfique.

Dans un kit ELISA, le détecteur utilisé est un anticorps. L'anticorps répondra de manière sélective à un type de structure chimique donnée. Dans le cadre de l'analyse des hydrocarbures pétroliers, les kits RaPID Assays Ohmicron ont démontré une bonne corrélation avec la méthode officielle par chromatographie gazeuse (8015M) et la méthode par spectroscopie infrarouge (418.1). Cependant, il est important, avant de faire le choix d'un kit, d'établir la nature de la contamination et d'étudier la réactivité du kit par rapport à l'hydrocarbure (cette dernière information pouvant être souvent fournie par le fabricant du kit). À partir de là, un choix de kit peut être effectué. Les données présentées ci-dessus sont données à titre indicatif. Une relation plus précise, entre les méthodes, peut être développée par l'utilisateur pour son échantillon et calibrer, ainsi, le kit pour obtenir des résultats qu'il pourra directement exprimer dans des unités qui lui seront plus familières.