Élimination des nitrites par bactéries fixées dans un réacteur biologique

L’oxydation des nitrites en nitrates est la nitratation, elle correspond à la dernière étape de la nitrification. Elle a lieu dans un milieu aérobie strict et résulte de l’action des bactéries nitriques autotrophes telles que Nitrobacter, Nitrosystis, Nitrospina, Nitrococcus (les deux premières ont pour habitat le sol et l’eau, les deux dernières la mer d’après Christon 1997). Ces bactéries utilisent l’énergie produite par l’oxydation des nitrites pour réduire le carbone minéral provenant soit du gaz carbonique soit des carbonates.

Élimination des nitrites par des bactéries autotrophes en présence d’un gel de polyacrylamide

Les conditions optimales pour l’élimination de l’azote sont :

• - milieu aérobie strict ;
• - carbone minéral ;
• - pH entre 7,2 et 8,5 ;
• - faible charge massique ;
• - âge des boues élevé.

Il est à noter que le temps de génération des bactéries de la nitrification est bien souvent le paramètre le plus contraignant pour le dimensionnement d’une installation devant nitrifier.

Les principales sources des nitrites sont :

• - une source naturelle : le cycle de l’azote qui fait circuler les nitrates et les nitrites à travers la chaîne alimentaire ;
• - une source artificielle : l’utilisation d’engrais azotés pour la fertilisation des sols.

Les nitrites sont très utilisés en industrie agroalimentaire (Michael Hill, 1991). En effet, ils sont appliqués comme additifs aux aliments tels que les charcuteries. Ils sont considérés comme des agents conservateurs et comme inhibiteurs des spores Clostri-

Mots clés : Eaux usées, réacteur biologique, nitrites, bactéries fixées, gel de polyacrylamide, propriétés physico-chimiques.

"Clostridium botulinum" naturellement présents dans la viande, et par suite prévenir la production de matière toxique.

Les nitrites sont également utilisés en industrie sidérurgique (Meinck et Stooff 1977). Leur rôle antioxydant permet de les ajouter aux huiles de perçage, fraisage, rabotage... Les besoins accrus en eau, le coût élevé de traitement des eaux usées et la nécessité de réutiliser l'eau traitée déterminent le choix d'un procédé de traitement. Plusieurs auteurs ont décrit des systèmes de nitrification des eaux usées basés sur des réacteurs biologiques (Mahne et coll. 1996, Hanne et Birgitte 1996). Dans toutes les applications effectuées les matériaux utilisés avaient pour unique objectif la fixation des bactéries épuratrices afin d’éviter leur lessivage du réacteur (Regis 1989, Baudu et coll. 1990, Arias 2001, Rostron 2001).

Les gels de polyacrylamide sont proposés dans cette étude pour leur double rôle : le premier est la fixation des bactéries nitriques grâce à la surface développée par le gel ; le second rôle est l'échange permanent d’éléments minéraux entre le gel et le milieu de culture.

Matériel et méthodes

Description du réacteur

La figure 1 décrit la composition de l’installation. L’effluent est acheminé vers le réacteur par une pompe péristaltique avec un débit d’entrée de substrat de 90 ml h⁻¹.

Le temps de séjour est de 4 jours ; le volume réel étant de 8,8 litres. L’oxygène dissous dans la culture varie entre 7 et 9 mg l⁻¹.

Le support de polyacrylamide est ensemencé à partir des boues activées ; le support colonisé servira ensuite à l’épuration d'un effluent synthétique enrichi en nitrites. Toutes les cultures ont été menées en continu dès l’ensemencement des gels par les boues.

Description du support

Le support utilisé est un gel de polyacrylamide sous forme de cristaux gélatineux de granulométrie (1 < A < 2 mm) et de dimensions non sphériques. Il est doté d'une surface rugueuse et d'une matière active qui est l’acrylamide, élément de base. Le support est un hydrorétenteur qui retient plusieurs centaines de fois son poids d’eau formant ainsi un hydrogel (tableau I).

Les polyacrylamides peuvent, suivant le procédé de fabrication, être plus ou moins réticulés. Après polymérisation, ils sont broyés pour obtenir une granulométrie inférieure à 3 mm. L'agent réticulant est le N,N' méthylène bis-acrylamide.

Le support de polyacrylamide anionique est copolymérisé par l’acrylate de sodium en présence d'un agent réticulant pour donner un polymère faiblement chargé. Sa densité est de 1,05, ce qui facilite sa mise en suspension dans le milieu de culture.

Le support de polyacrylamide cationique est copolymérisé par le diméthylaminoéthyl en présence du même agent réticulant. Sa densité est de 1,1.

Milieu de culture

Pour développer une culture riche en bactéries nitriques telles que celles du genre Nitrobacter, il faut utiliser un milieu riche en nitrites.

Les composantes principales du milieu de culture enrichi en nitrites sont : NaNO₃ : 0,49 g l⁻¹ Na₂HPO₄ : 5,0 g l⁻¹ KH₂PO₄ : 0,5 g l⁻¹

À ces trois éléments principaux nous avons ajouté quelques microgrammes d’oligo-éléments tels que fer, zinc, cuivre et magnésium. Le pH du milieu est voisin de 7,6-7,8.

Culture sur support anionique

Toutes les cultures ont été menées en continu dès l’ensemencement par les boues. Les différentes étapes de l'expérimentation sont représentées sur la figure 2 et peuvent être résumées comme suit :

– Développement d’une culture de bactéries nitriques dans un réacteur triphasique (air, boues activées et gel) alimenté en continu par du milieu nutritif enrichi en nitrites (N-NO₂ = 0,1 g l⁻¹) : culture 1 (C1). – Séparation des deux phases : milieu de culture et gel et remise en culture de chacune d’elles dans deux réacteurs différents (respectivement culture 2 ou C2 et culture 3 ou C3). – Suivi analytique de la nitratation dans le réacteur initial puis dans les cultures réalisées à partir de chacune des deux phases séparées (cultures 2 et 3).

Culture sur support cationique

Le gel cationique a été ensemencé à partir de la phase liquide de la culture C3 pour for-

Tableau I : Hydratation des supports dans l'eau distillée et dans une suspension de boues activées

Démarrer la culture C4.

Les étapes des expérimentations qui ont suivi cet ensemencement sont identiques à celles qui ont été suivies dans le cas du gel anionique.

Les paramètres étudiés

Un suivi analytique des concentrations en nitrites et en nitrates permet d’évaluer l’activité des bactéries nitrifiantes dans le réacteur.

Les trois paramètres : oxygène dissous, température et pH permettent de suivre les conditions physiques du déroulement des cultures nitrifiantes.

Le pH de la culture est surveillé afin de le maintenir dans une zone favorable à une activité nitrifiante optimale (entre 7 et 8,8).

Conductivité : les mesures de conductivité ont permis d’étudier la rétention des ions minéraux par l’hydrorétenteur après mise en suspension dans la solution minérale. Ces mêmes mesures ont également été effectuées pour le suivi du relargage, lors du lavage, des ions retenus par l’hydrogel.

Résultats

La figure 3 montre l’évolution de la production des nitrates en fonction du temps pour les trois cultures (C1, C2 et C3). Nous avons vérifié que les nitrites étaient à l’état de traces dans la solution après huit jours de culture.

Comme on pouvait le prévoir, seule la culture C1 présente un temps de latence (sept jours) en correspondance avec le facteur stimulant que représente l’alimentation enrichie en nitrites pour les populations nitrifiantes. On note que les valeurs maximales s’établissent dans tous les cas à une concentration de l’effluent de sortie supérieure à celle de la concentration attendue de 100 mg·l⁻¹.

On note également que le délai avec lequel le plateau est atteint semble plus important pour la culture C3, probablement en raison de la présence du gel et de la rétention qu’il exerce sur une partie des nitrates produits.

Les concentrations en nitrates au temps zéro des cultures C2 et C3 sont élevées. Elles résultent, d’une part, d’une activité nitrifiante lors de la culture initiale et, d’autre part (pour C3), d’un relargage dans le milieu de culture « neuf » des nitrates retenus par le gel au cours de la culture initiale (C1).

L’évolution de la production en nitrates de la culture continue réalisée à partir de la culture 2 (solution isolée de la culture initiale) est illustrée sur la figure 3. Cette production est maximale dès le huitième jour de la culture.

L’utilisation du gel cationique fait apparaître certaines particularités dans le réacteur : au début de la culture le gel induit l’apparition d’un trouble dans le milieu liquide qui disparaît complètement après une semaine. Par ailleurs, l’aspect physique du gel évolue : translucide au départ, il devient blanchâtre après un mois environ. Enfin, les grains qui constituent le gel sont adhérents les uns aux autres alors qu’ils étaient parfaitement isolés dans le cas du gel anionique.

La figure 4 montre la production de nitrates après remise en culture du gel cationique. Elle met en évidence une phase exponentielle d’environ treize jours et l’absence de phase de latence. On note la disparition des nitrites à partir du dixième jour, ce qui peut être interprété comme le début de la phase pour laquelle le rendement d’activité est de 100 %. Le poids du gel cationique isolé a diminué de 484 g après ensemencement, au démarrage du réacteur, à 252 g à la fin de l’expérimentation. La différence indique que le gel s’est chargé en ions minéraux.

dont on sait qu’il s’accompagne d'un relargage d’eau (Aoun J., 1991, Bouaoun D., 1991).

Modes opératoires

Étude des propriétés physico-chimiques des gels polyacrylamides

L’objectif de cette étude est de mettre en évidence l'affinité des deux supports (anionique et cationique) à l’eau et aux substances dissoutes. Cette caractéristique se traduit par un phénomène d’expansion (gonflement) de l’hydrogel.

Quatre expériences sont décrites dans cet article. Les deux premières (expériences 1 et 2) concernent les capacités du gel en matière de rétention d’eau. Les deux autres (expériences 3 et 4) concernent ses capacités à retenir deux formes de l’azote minéral (N-NO₂ et N-NO₃).

L’expérimentation 1, réalisée à partir d’eau distillée, avait pour but d’évaluer la quantité maximale de gel pouvant être utilisée sans qu'il y ait gélification du mélange. L’expérimentation 2, réalisée à partir d'une suspension de boues activées, était justifiée par l’hypothèse qu’à volume égal, la gélification du mélange pour un même poids d’hydrogel est plus probable dans le cas d'une suspension de boues que dans celui de l’eau. L’expérimentation 3 concerne l’étude de la rétention par le gel d’azote nitreux et du comportement des deux supports en présence de la solution nutritive enrichie en nitrites.

L’expérimentation 4, réalisée à partir d'une solution minérale enrichie en nitrates, permet d’étudier la rétention de la solution par les deux supports et de s'approcher ainsi des concentrations en nitrates produits par la nitrification dans les bioréacteurs.

Expérimentations sur les capacités de rétention d’eau par les gels (exp. 1 et 2)

Dans l’expérimentation 1, 1 g d’hydrorétenteur à l'état sec est ajouté à 500 ml d'eau distillée. Dans l’expérimentation 2, l’eau distillée est remplacée par 500 ml d'une suspension de boues activées prélevées du bassin biologique de la station d’épuration de la ville de Chambéry.

Après que l’équilibre ait été atteint (ce moment est apprécié par la stabilisation de la conductivité de la solution), les deux phases (gel et liquide) sont séparées. Le volume de l’hydrogel est alors calculé à partir du rapport de son poids sur sa densité. Le volume de la phase liquide est également mesuré.

Expérimentations sur les capacités de rétention de l’azote par les gels (exp. 3 et 4)

1 g d'hydrorétenteur est mis en suspension dans 250 ml de la solution minérale nutritive, enrichie en nitrites ou en nitrates à différentes concentrations (10 à 100 mg l⁻¹ en N-NO₂ et de 10 à 140 mg l⁻¹ en N-NO₃). Les tableaux II et III regroupent les résultats des expérimentations. La solution enrichie en nitrites a été choisie parce que c’est elle qui est utilisée dans les expériences sur la nitratation dans les bioréacteurs.

La composition des solutions enrichies en nitrates est la suivante :

• KNO₃ : 0,07 à 1,01 g l⁻¹
• Na₂HPO₄ : 5,0 g l⁻¹
• KH₂PO₄ : 0,5 g l⁻¹

Cette étude est justifiée par le fait que l’activité nitrifiante qui se développe dans les réacteurs a pour conséquence une évolution de la composition chimique de la phase liquide et donc une évolution parallèle du comportement des hydrorétenteurs vis-à-vis des ions de cette solution.

Ces mises en suspension ont été effectuées pour les deux supports anionique et cationique.

Après 24 heures de mise en rétention, nous avons procédé à la séparation des phases puis à l’analyse de la forme de l’azote étudiée dans la phase liquide. Les résultats ont permis le calcul du bilan de l’azote et donc de la distribution de cet élément dans les phases liquides et solides.

Résultats et discussion

Le tableau I montre que :

• Le taux de gonflement du support anionique de granulométrie comprise entre 1 et 2 mm est plus important que celui du même support à plus faible granulométrie (A < 1 mm).
• Le taux de gonflement du support cationique est inférieur à celui du support anionique dans l’eau distillée.
• Le taux de gonflement du support cationique dans les boues activées est plus important que celui du support anionique.

À l’équilibre, le taux de gonflement relatif (TGR) est calculé d’après l’équation :

TGR (%) = (Volume du gel filtré des boues activées / Volume du gel filtré de l’eau distillée) × 100

Les valeurs du tableau I dépendent des concentrations des différents éléments minéraux présents dans les boues activées.

Formulations théoriques des paramètres caractéristiques des différentes phases des pilotes de nitrification

Dans un milieu hétérogène, à l’équilibre nous pouvons écrire l’équation suivante :

quantité ajoutée = quantité phase liquide + quantité retenue par le gel.

Co Vo = Cs Vs + Cg Vg (1)

où :

Co est la concentration initiale de la solution (mg l⁻¹). Vo est le volume initial de la solution (ml). Cs est la concentration du surnageant à l’équilibre (mg l⁻¹). Vs est le volume du surnageant à l’équilibre.

Tableau II

Etude de rétention d'azote nitreux par les deux gels

à partir du milieu nutritif enrichi en nitrites

Volume de la solution = 250 ml

Densité du gel = 1,05

Volume du gel dans l'eau distillée = 387 ml

Granulométrie de 1 à 2 mm.

Volume de la solution = 250 ml

Densité du gel = 1,1

Volume du gel dans l'eau distillée = 199 ml

Granulométrie de 1 à 2 mm.

(ml).

Cg est la concentration dans la phase gel à l’équilibre (mg/l).

Vg est le volume du gel à l’équilibre (ml).

Ce bilan nous permet de calculer la quantité d’éléments azotés retenue par le support :

        CoVo − CsVs  
Cg =               (2)  
            Vg  

La fraction d’azote minéral retenue par le gel au moment de l’équilibre est définie par l’expression :

  CgVg × 100  
           (3)  
    Covo  

Celle de l’azote subsistant dans la phase liquide et donc non retenue par la phase gel est donnée par l’expression :

  CsVs × 100  
           (4)  
    Covo  

Le coefficient de partage défini comme le rapport des concentrations dans les deux phases est alors :

    CgVg  
Cr =        (5)  
    CsVs  

Le gel peut aussi être défini par la notion de performance caractéristique généralement appliquée aux membranes. L’emprunt de cette caractéristique est justifié par le comportement membranaire du gel dans de nombreuses conditions expérimentales (Aoun J., 1991).

Appliquée au gel, la performance caractérise son affinité pour l'azote minéral et détermine en conséquence l'importance des quantités de cet élément qu'il sera capable de retenir. Cette caractéristique est également liée à la quantité de solution retenue simultanément par le gel.

    Ln Co/Co  
p =          (6)  
    Ln Vo/Vg  

L'une des particularités des gels polyacrylamides est liée à la rétention des éléments minéraux qui est inversement proportionnelle au volume du gel. Les évolutions des concentrations en nitrites et en nitrates dans les deux gels en fonction de la concentration de la solution initiale sont représentées sur les figures 5 et 6. La figure 7 montre que la concentration en nitrites augmente plus rapidement dans le gel cationique que dans le gel anionique contrairement à ce qui avait été observé dans le cas des nitrates. Dans ce cas en effet, l’évolution sur les deux gels

Vg est donnée par l'expression :

1 + C2Vg mg N-NO₂ =  
CgVg mg N-NO₂  
CgVg mg N-NO₂  
CgVg mg N-NO₃  

était identique jusqu'à la valeur de 40 mg/l pour Co.

La figure 5 montre que la rétention d’ions NO₃⁻ par le support anionique n’est pas limitée par la concentration de la solution initiale dans la gamme des concentrations étudiées (10 à 140 mg/l).

Le tableau II montre que les variations de Cg en fonction de Co sont identiques pour les deux gels jusqu'à la concentration de 40 mg/l pour Co.

Les valeurs de Cg au-delà de Co = 40 mg/l n'ont pas été reportées sur la figure dans la figure 6 en ce qui concerne le gel cationique.

En effet, le calcul de la concentration du gel en NO₃⁻ (Cg) donne au-delà de cette concentration des valeurs négatives et ceci pour les trois expérimentations identiques qui ont été conduites à ce sujet. Ce résultat traduit probablement un changement du comportement du gel à partir de la concentration de la solution initiale de 60 mg/l. Ce phénomène peut être la conséquence d'une compétition entre ions nitrates et phosphates vis-à-vis des sites de fixation sur le gel.

Les tableaux II et III représentent le partage des nitrates entre le gel et la solution. Ils montrent que la concentration des nitrates retenus par l’hydrogel augmente avec celle de la phase liquide. L’augmentation de la concentration de la phase liquide en nitrates (Tableau III) due à l'absorption d'eau par le gel est compensée en partie par le fait que le gel s'enrichit lui-même, par adsorption en nitrates. Ce phénomène est complexe car lorsque la concentration en nitrates de la solution initiale augmente, on observe d’une part une diminution de la quantité d’eau absorbée par le gel (Vg), d’autre part une augmentation de la quantité de nitrates qu’il retient (Cg).

Conclusion

L’étude qui précède a montré que les bactéries nitriques peuvent se fixer sur les gels de polyacrylamide : anionique et cationique. Le suivi analytique de la production des nitrates dans la seconde culture des expérimentations qui ont été conduites (culture C2, Figure 2) montre un développement rapide des cultures nitriques et un rendement d’élimination des nitrites de 99,7 % après 8 jours de culture.

Le niveau d'équilibre des concentrations de nitrates se maintient dans la plupart des cas à un niveau supérieur à 100 mg/l. Ces niveaux de concentrations résultent soit d'une accumulation de nitrates dans les réacteurs, ou bien plus probablement d'une forte rétention des nitrites par les gels au moment de l’alimentation (qui seront oxydés ultérieurement dans le cadre d’un nouvel équilibre qui se réalise avec la phase liquide du réacteur lors de la phase plateau des courbes).

Nous avons pu étudier quelques-unes des propriétés physiques et chimiques des gels de polyacrylamide lorsqu’ils sont immergés dans des solutions minérales identiques à celles utilisées pour la culture de bactéries nitrifiantes.

Nous pouvons conclure que le taux de rétention des ions dans un gel dépend de sa nature (anionique ou cationique) et de la

Tableau III : Étude de rétention d'azote nitrique par les deux gels à partir du milieu nutritif enrichi en nitrates

Volume de la solution = 250 ml Volume du gel dans l'eau distillée = 387 ml Granulométrie de 1 à 2 mm.

Volume de la solution = 250 ml Densité du gel = 1,1 Volume du gel dans l'eau distillée = 199 ml Granulométrie de 1 à 2 mm.

La concentration en éléments minéraux dans la solution dans laquelle il est immergé influence le volume de l’hydrogel, qui varie de façon inversement proportionnelle à la concentration (Cg) des ions qu'il retient.

L'augmentation de la concentration en NO3- est plus importante dans le gel cationique que dans le gel anionique lorsque la concentration de ces ions augmente dans la phase liquide. La rétention des nitrates par le support anionique n’est pas limitée par la concentration en nitrates de la solution dans la gamme des concentrations utilisées. D’autres éléments minéraux présents dans la solution, et probablement aussi retenus en partie par l’hydrogel, sont susceptibles d’intervenir sur la rétention des formes minérales de l’azote.

L'évolution de ces relations entre la solution minérale et le gel était importante à considérer. Elles signifient en effet que les modifications de la composition minérale du milieu, qui se produisent aux différentes étapes de la culture des bactéries nitrifiantes, auront une incidence sur l’équilibre en eau et en sels du gel avec son environnement liquide.

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