La présence de pesticides dans l'eau, les sols et les produits alimentaires et leur effet potentiel sur la santé des personnes est un problème qui attire de plus en plus l'attention des pouvoirs publics. De ce fait, la législation concernant les pesticides est devenue de plus en plus exigeante au fil des ans, nécessitant la réalisation de tests de plus en plus sensibles et de plus en plus nombreux. En 1985, par exemple, la CEE a émis une directive sur l'eau potable (n° 80/778/CEE) fixant les normes sur la qualité de l'eau potable ; dans cette directive, les pesticides sont considérés comme un groupe unique, avec une Concentration Maximale Acceptable (CMA) fixée à 0,1 ?g/l pour chaque substance du groupe et 0,5 ?g/l pour l'ensemble des pesticides et de leurs dérivés.
Des contrôles de cette nature sont appelés à se développer largement à l'avenir sous la pression de l'opinion publique. Des méthodes conventionnelles telles que la CLHP ou la CG-MS permettent déjà la détermination des concentrations en pesticides aux niveaux requis par la législation. Toutefois, elles nécessitent un investissement important dans un équipement sophistiqué, servi par des techniciens bien expérimentés ; par ailleurs, leur débit est relativement faible, les procédures analytiques étant longues.
Il existe dès lors un besoin pour un test rapide, simple et moins coûteux qui permettra de réaliser aisément un nombre important d'analyses sur le terrain ou au laboratoire, de façon à soulager les systèmes CLHP ou GC-MS en ne leur présentant que des échantillons positifs. Les tests immuno-enzymatiques, utilisés depuis plus de quinze ans dans les laboratoires d'analyse médicale, répondent à cette définition.
Description d’un immuno-essai
Les anticorps
Les anticorps sont des molécules de haut poids moléculaire (160 000 Daltons) que sécrètent les cellules du système immunitaire en réponse à une stimulation par une molécule étrangère à l’organisme (antigène). L'immunoglobuline de type G (IgG) est un anticorps couramment utilisé dans les tests immuno-enzymatiques. Cette molécule est constituée de deux chaînes « lourdes » et de deux chaînes « légères » d’acides aminés liées entre elles par des ponts disulfures. Une molécule d'IgG est représentée schématiquement dans la figure 1.
La forme de la molécule évoque grossièrement celle d’un Y. La nature des acides aminés constituant les deux branches supérieures de l’Y est variable, et sera modifiée par les cellules stimulées jusqu’à ce qu'elle corresponde parfaitement à certaines structures (épitopes) de la molécule étrangère ainsi qu'il en va d’une serrure et d’une clé.
Il est dès lors possible d’induire, par différentes méthodes, la production d’anticorps qui « reconnaîtront » une molécule spécifique (c'est-à-dire qui se lieront fortement à cette molécule par des liaisons électrostatiques, des forces de Van der Waals et des ponts hydrogène).
La production d’un anticorps spécifique
La source des anticorps utilisés dans l’immuno-essai est un animal. Il s’agit généralement d’un lapin, d’un cochon d’Inde, d’une chèvre, ou d'une souris. Les quantités d’anticorps requises pour réaliser un test immuno-enzymatique étant très faibles, un seul lapin peut, au cours de son existence, subir suffisamment de prélèvements sanguins pour réaliser jusqu’à un million de tests. Toutefois, la production d’anticorps par le système immunitaire ne sera pas stimulée par des molécules de poids moléculaire inférieure à 5 000 Daltons. L’injection directe de pesticides ne déclenchera donc aucune produc-
La production d’immunoglobulines chez l’animal.
Il est dès lors nécessaire de recourir à un artifice : la molécule de faible poids moléculaire sera fixée par liaison covalente à une molécule de haut poids moléculaire et l’ensemble, une fois injecté, déclenchera la réponse immunitaire. C’est ainsi que, par exemple, pour induire la production d’un anticorps dirigé contre le paraquat, on synthétisera tout d’abord une molécule analogue qui sera ensuite conjuguée à une protéine telle que l’albumine bovine [1] (figure 2). L’anticorps ainsi produit est capable de reconnaître non seulement l’haptène contre lequel il était dirigé, mais aussi la molécule de faible poids moléculaire seule.
L’anticorps est récolté du sang de l’animal immunisé et purifié par différentes techniques de biochimie. Une séparation par chromatographie d’affinité, utilisant comme ligand l’analogue du pesticide, constitue une étape élégante dans un tel processus de purification. (Afin d’éviter que les IgG produites ne prennent également pour cible certaines structures moléculaires de l’albumine bovine, il convient de s’efforcer de lier plusieurs molécules analogues du pesticide à chaque molécule d’albumine, de façon à en recouvrir au mieux la surface.)
Le mécanisme du test immuno-enzymatique
Le test immuno-enzymatique (en anglais, ELISA pour Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) est produit comme suit :
• l’anticorps purifié est fixé en production sur un support solide (généralement le fond de tubes à essai en plastique) ; chaque tube reçoit la même quantité d’anticorps ;
• une série de réactifs est également fabriquée ; parmi eux se trouve le conjugué enzymatique : une molécule du pesticide à détecter couplée à un enzyme par une liaison covalente.
Le coffret de réactifs utilisé à cet effet comprend les tubes avec anticorps spécifiques, les réactifs et une gamme de solutions-étalons (généralement un blanc et deux ou trois solutions standard).
Lors de l’utilisation du test, la séquence des opérations se déroule comme indiqué ci-après :
• dans une première étape, des échantillons ou des solutions-étalons de pesticide (molécules représentées par des billes rouges) sont introduites dans les tubes à essai dont les parois sont recouvertes d’anticorps (molécules en forme de Y) ; ces anticorps, dirigés contre le pesticide à détecter, sont responsables de la grande spécificité du test. Ils sont présents en nombre égal dans chaque tube ;
• un premier réactif est alors ajouté : une solution de molécules de pesticides liées par covalence à un enzyme (conjugué enzymatique). Le pesticide « libre » introduit à la première étape dans l’échantillon et le pesticide « marqué » par l’enzyme (conjugué enzymatique) entrent alors en concurrence pour se lier aux molécules d’anticorps fixées sur les parois du tube ;
• après une période d’incubation, les tubes sont lavés à l’eau à plusieurs reprises. Seules les molécules de pesticide (« libres » ou « marquées ») qui se sont liées à l’anticorps resteront dans le tube. La quantité de molécules de pesticide « marquées » par un enzyme restant dans le tube sera donc inversement proportionnelle à la quantité de pesticides présentes dans l’échantillon ;
• on ajoute ensuite une solution d’un substrat (S) spécifique de l’enzyme, et, immédiatement après, une solution de chromogène (C) ;
• l’enzyme va catalyser la conversion de substrat (S) en produit (P) qui, à son tour, va réagir avec le chromogène (C) pour développer une coloration. Pour certains enzymes, le substrat est incolore et le produit (P) coloré, ce qui élimine la nécessité de l’addition d’un chromogène. Chaque molécule d’enzyme catalyse la conversion de milliers de molécules de substrat en produit. C’est cet effet de démultiplication qui explique la grande sensibilité du test ;
• après une période de développement, la réaction catalysée par l’enzyme est bloquée par l’addition d’un réactif (généralement un acide) qui détruit l’enzyme. La densité optique de la solution est alors mesurée à la longueur d’onde d’absorption maximale du chromogène ou du produit. Une concentration élevée en pesticide dans l’échantillon ou la solution-étalon se traduira par une faible coloration en fin de test.
Les réactions mises en jeu dans cette méthode étant de nature biologique, elles sont fortement influencées par les variations de température ; c’est pourquoi il est souhaitable de réaliser une nouvelle courbe d’étalonnage à chaque fois que des tests doivent être effectués. Ceci permet de minimiser des variations dues à l’âge du kit, aux circonstances de sa production (n° de lot), ainsi qu’à la température des réactifs et de l’échantillon au moment où le test est réalisé. Dans le même esprit, il est recommandé d’exprimer les résultats obtenus lors de tests quantitatifs non pas sous la forme d’unités d’absorbance, mais plutôt comme le rapport entre l’absorbance d’une solution de calibration ou d’un échantillon et celle du contrôle négatif, ce rapport étant désigné par le terme « %BO » :
DO de l’échantillon
%BO = ———————————— × 100
DO du contrôle négatif
Cela permet de réduire les variations observées dans la construction de courbes d’éta-
lorsqu’on utilise successivement des kits de lots différents.
Il est également important de conserver les coffrets de réactifs entre 4 et 8 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés, afin d’éviter une dégradation prématurée des composants.
La sélectivité des tests immuno-enzymatiques
La grande spécificité d’un anticorps est illustrée dans la figure 9, qui montre la concentration (exprimée en g/l) de différentes molécules de structure similaire nécessaire pour réduire à 50 % la réaction de conversion du substrat en produit dans un kit de détection des triazines [2]. On remarquera que la liaison est plus forte pour des composés de structure très proche de l’atrazine, c’est-à-dire des molécules disposant de groupes 4-éthylamino et 6-isopropylamino. L’effet d’inhibition le plus prononcé est bien entendu dû à l’atrazine, car cette molécule est extrêmement semblable à l’haptène utilisé pour générer les anticorps polyclonaux utilisés dans le kit.
Cette sélectivité du test immuno-enzymatique est également démontrée par le fait que les composés suivants ne sont pas détectés, à une concentration de 1000 ppb : Alachlor, Aldicarb, Azinphos methyl, Carbaryl, Carbofuran, Glyphosate, Mancozeb, Maneb, Methamidophos, Metolachlor, Trichlopyr et 2,4-D. [3]
La sensibilité des tests immuno-enzymatiques
Le tableau 1 indique la Dernière Dose Décelable (DDD – correspond à 90 % de la valeur de la DO du blanc) pour différents produits lors de l’utilisation d’un kit de détection de l’atrazine [3]. Ces données montrent la grande sensibilité du test immuno-enzymatique.
La courbe de calibration présentée sur la figure 10 indique la relation existant entre le % BO et la concentration en atrazine (exprimée en ppb) pour le kit « Millipore Envirogard Triazine plaque ». Comme on peut le constater, la sensibilité du test est maximale entre 0,1 et 1 ppb.
Exemple d’utilisation de réactifs immuno-enzymatiques pour la détection de pesticides : les kits « Envirogard »
Ces kits constituent un exemple de produits permettant la détection des pesticides. Les anticorps utilisés dans ces kits pour fixer les pesticides lors de l’étape d’incubation sont de type polyclonal. Ils sont produits au départ d’analogues du pesticide à détecter couplés par liaison covalente à de plus grandes molécules, telles que l’albumine, et injectés à des lapins.
L’enzyme utilisé par le marquage des pesticides est le peroxydase de raifort. Il s’agit d’une protéine d’un poids moléculaire de 40 000 Daltons, capable de catalyser la conversion de plus de 30 000 molécules d’eau oxygénée (H₂O₂) par minute dans des conditions standard [4].
Le chromogène employé pour visualiser le développement de la réaction est la tétraméthyl benzidine, composé fréquemment utilisé pour la détection de l’activité enzymatique de la peroxydase de raifort [5] et qui offre l’avantage, au contraire de son analogue, la benzidine, de ne présenter aucune activité carcinogène [6], [7], [8]. La structure de ce réactif est présentée sur la figure 11. La réaction enzymatique conduit à la génération d’un composé d’une couleur bleue intense. L’addition d’acide sulfurique dilué après un temps donné conduit à l’arrêt de la réaction enzymatique et au changement de coloration du chromogène du bleu au jaune, avec un maximum d’absorption à 450 nm.
Pratiquement, les kits sont présentés sous deux formes :
Les kits « tubes » destinés plutôt à l’usage sur le terrain
Dans ces kits, les anticorps spécifiques du pesticide à détecter sont immobilisés au fond de tubes en plastique, et l’étape de compétition entre le pesticide à l’état libre et le pesticide marqué par le peroxydase est délibérément arrêtée avant que l’équilibre ne soit atteint (soit après 5 à 10 minutes). Les concentrations en anticorps et en réactifs sont adaptées à cette mesure « cinétique » qui offre l’avantage de ne nécessiter qu’une courte période d’incubation, caractéristique
Tableau I
| Composé | DDD (µg/L) | Composé | DDD (µg/L) |
|---|---|---|---|
| 6-hydroxy atrazine | 0,01 | Prometron | 0,01 |
| Ametrine | 0,001 | Prometryne | 0,015 |
| Atrazine | 0,037 | Propazine | 0,014 |
| Cyanazine | 0,23 | Simazine | 0,004 |
| Deethylatrazine | 0,30 | Simetryne | 0,003 |
| Didealkylatrazine | — | Terbuthylazine | 0,06 |
| Trietazine | 0,008 |
Tableau II
| Type d’eau dopée | Quantité injectée | Détecté par CLHP | Détecté par MIE |
|---|---|---|---|
| Eau de rivière | 10 | 12 | 11 |
| Eau de puits | 4 | 4 | 3 |
| Eau de rejet | 10 | 8 | 9 |
| Eau de mare | 10 | 10 | 10 |
Tableau III
Détection du paraquat dans des échantillons dopés d'eau de nappe phréatique
| Échantillon dopé | Quantité ajoutée | Quantité détectée | Récupération (%) |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,030 | 0,023 | 78 |
| 2 | 0,040 | 0,047 | 119 |
| 3 | 0,070 | 0,077 | 110 |
| 4 | 0,070 | 0,074 | 107 |
| 5 | 0,090 | 0,096 | 107 |
| 6 | 0,110 | 0,120 | 109 |
| 7 | 0,150 | 0,172 | 115 |
| 8 | 0,150 | 0,160 | 106 |
| 9 | 0,190 | 0,255 | 134 |
| 10 | 0,190 | 0,189 | 99 |
Quantité ajoutée : concentration en paraquat dans l’échantillon dopé, exprimée en ppb (parties par milliard).
Quantité détectée : concentration en paraquat (en ppb) déterminée sur le même échantillon à l’aide d’un test immuno-enzymatique (kit Envirogard Paraquat plaques de Millipore SA).
Tableau IV
Détermination de la concentration en atrazine dans le sol après extraction à l’aide d’un solvant organique [11]
| Test | MIE | CLHP | Test | MIE | CLHP |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1900 | 1370 | 10 | 2 | N.D. |
| 2 | 1700 | 1630 | 11 | 12 | 7 |
| 3 | 1100 | 810 | 12 | 20 | 21 |
| 4 | 880 | 660 | 13 | 52 | 83 |
| 5 | 86 | 95 | 14 | 42 | 20 |
| 6 | 4 | 6 | 15 | 26 | 13 |
| 7 | 42 | 10 | 16 | 7 | 5 |
| 8 | 37 | 42 | 17 | 5 | 15 |
| 9 | N.D. | N.D. | 18 | 22 | 1 |
Test : numéro de l’échantillon.
MIE : résultat du test immuno-enzymatique (ppb).
CLHP : résultat du test chromatographique (ppb).
Il est particulièrement utile pour un test à effectuer sur le terrain.
La détermination de la concentration en pesticide peut être réalisée par une simple évaluation visuelle de l’intensité de la couleur bleue obtenue après deux minutes de révélation, la coloration de l’échantillon étant comparée à celle d’un blanc et d’une solution standard.
Ce type de mesure permet de déterminer si la concentration en pesticide dans l’échantillon est inférieure ou supérieure à celle de la solution standard ; sa précision peut toutefois être affectée par l’acuité visuelle de l’utilisateur.
Une mesure de la densité optique réalisée à 450 nm après virage de la coloration au jaune est à la fois plus facile, plus précise et plus objective. Ce type de détermination peut être réalisé à l’aide d’un photomètre de terrain, sur un volume inférieur à un demi-décimètre cube, fonctionnant sur batterie. Les résultats obtenus dans ces conditions sont semi-quantitatifs.
Les kits « plaque » destinés au laboratoire
Dans ces kits, les anticorps spécifiques du pesticide à détecter sont immobilisés au fond de puits de plaques de microtitration. Chaque plaque contient 12 barrettes de 8 puits qui peuvent être utilisées indépendamment.
L’étape de compétition entre le pesticide à état libre et le pesticide marqué est allongée (60 minutes) de façon à ce que l’équilibre soit atteint. La réaction de révélation de l’activité de la peroxydase est également prolongée (30 minutes). Il en résulte à la fois une meilleure précision, qui fait de ce kit un test quantitatif, et une plus grande sensibilité. La lecture des résultats s’opère à 450 nm, à l’aide d’un lecteur de barrettes ou de plaques. Les kits « plaque » permettent à un seul technicien de réaliser des centaines de tests en une journée.
Corrélation de la méthode immuno-enzymatique avec des techniques conventionnelles
De nombreuses publications ont comparé les résultats obtenus par la méthode immuno-enzymatique (MIE) à ceux générés par des méthodes plus conventionnelles telles que la Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) ou la Chromatographie en phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (CG-SM).
Le tableau II met en évidence le recouvrement par CLHP et par MIE d’atrazine ajoutée à différents types d’eau [9] ; tous les résultats sont exprimés en ppm d’atrazine.
Des corrélations similaires ont été obtenues entre la MIE et la GC-MS pour la détection de l’atrazine dans des eaux provenant de nappes phréatiques et des eaux de surface, ainsi que l’indiquent les graphiques présentés sur les figures 12 et 13 [2].
Des résultats similaires ont été obtenus lors de la détection d’autres types de pesticides par MIE ainsi qu’en témoignent, par exemple, les résultats présentés dans le tableau III [10].
La grande sensibilité des méthodes immuno-enzymatiques peut être encore accrue par une étape de concentration des pesticides à détecter à l’aide de l’extraction en phase solide (EPS). Les tests immuno-enzymatiques supportent en effet des concentrations en méthanol allant jusqu’à 20 % (V/V) dans l’échantillon. Il est donc concevable de passer un volume d’eau important (de l’ordre du litre) à travers une mini-cartouche de chromatographie (par exemple, de type phase inverse C18), ensuite d’éliminer l’eau par un passage d’air, puis d’éluer les pesticides immobilisés sur la phase inverse à l’aide d’un volume réduit (2 ml) de méthanol qui sera ensuite dilué par 8 ml d’eau de qualité réactif afin de maintenir la concentration en méthanol dans des limites acceptables.
Si la solubilité du pesticide à détecter le permet, on préférera toutefois faire évaporer à sec l’éluat méthanolique, et redissoudre les constituants solubles en phase aqueuse.
Le résultat d’une telle opération est une concentration par un facteur 100 du pesticide présent en solution.
De telles méthodes de concentration doivent bien entendu être validées pour chaque pesticide dans le sol. Là aussi, une bonne corrélation existe entre cette nouvelle méthode et une technique éprouvée telle que la CLHP, ainsi qu’en font foi les résultats présentés dans le tableau IV.
[Schéma : Structure du tétraméthyl benzidine.]Conclusion
Les méthodes immuno-enzymatiques, vu leur sélectivité et leur sensibilité, leur simplicité d'utilisation et leur rapidité, ainsi que leur faible coût constituent une excellente technique de criblage, permettant de réduire fortement le nombre d’échantillons à tester par des méthodes existantes (CLHP, CG-SM) en évitant d’analyser des échantillons ne contenant pas de pesticides. Ils permettent de ce fait d’étendre le nombre de points de contrôle sur le terrain et d’augmenter la fréquence de ces contrôles de façon à en améliorer la signification statistique.
Par ailleurs, la disponibilité de tests destinés au terrain permet de simplifier la collecte et le transport des échantillons en réduisant leur volume et offre aussi l'avantage d’informer immédiatement les personnes directement concernées par une pollution de l'eau par les pesticides.
Ces tests peuvent enfin être utilisés comme une méthode de confirmation rapide de résultats obtenus par CLHP ou CG. Leur disponibilité permet donc de reconsidérer les stratégies de détection des pesticides afin d’accroître la qualité du contrôle de l’environnement tout en maintenant les coûts en matériel et en personnel dans des limites raisonnables.
BIBLIOGRAPHIE
[1] Van Emmon Jeanette et Lopez-Avila Viociara, Immunochemical Methods for Environmental Analysis, Analytical Chemistry, vol. 64, n° 2, janvier 1992, pp. 79A-88A.
[2] Thurman E.M. et al., Enzyme-linked Immunosorbent Assay compared with Gas Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of Triazine Herbicides in Water, Analytical Chemistry, septembre 1990, pp. 2043-2048.
[3] Données extraites du mode opératoire du kit Millipore Envirogard Triazine.
[4] Maehly A.C., in « Methods in Enzymology », vol. II (Colowick S.P. and Kaplan N.O., eds.), Academic Press, New York, 1955, p. 807.
[5] Anal. Biochem., 1976, 75, 168.
[6] Tetrahedron, 1974, 30, 3299.
[7] Cancer Lett., 1975, 39.
[8] J. Forensic Sci., 1976, 816.
[9] Données extraites de la brochure Millipore EU 341.
[10] Données non publiées obtenues dans les laboratoires d'application de Millipore (Bedford, Mass., U.S.A.) lors de l'évaluation du kit Envirogard Paraquat.
[11] Bushway R.J. et al., Determination of Atrazine Residues in Water and Soil by Enzyme Immunoassay, Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1988, 40, pp. 647-654.
